Methylenblåt og ferroptose: mekanismen bag lipidperoxidation

Ferroptose er celledød som følge af membranskader. Flerumættede fedtstoffer i membraner oxideres i en kædereaktion, membranen svigter, og cellen dør. Jern er nødvendigt for reaktionen. Det er hele grundideen, og alt i denne artikel undersøger en del af den.

Spørgsmålet her er mere afgrænset: Hvad gør methylenblåt ved denne kæde i celleforsøg, og hvad viser resultatet egentlig? Det korte svar er, at methylenblåt i nanomolære koncentrationer i to laboratoriestudier reducerede mitokondriel lipidperoxidation og holdt celler i live efter påvirkninger, som ellers udløser ferroptose. Det længere svar er vigtigere, fordi hvert led i kæden blev undersøgt med et forskelligt indgreb, og hvert indgreb har sine begrænsninger.

Ferroptose i ét afsnit

Et membranfosfolipid med en flerumættet fedtsyrehale har et svagt punkt: hydrogenatomer, der er lette at stjæle. Når et radikal stjæler et af dem, bindes ilt til lipidet, der dannes et lipidperoxylradikal, og dette radikal stjæler fra det næste lipid. Reaktionen forplanter sig langs membranen, medmindre noget stopper den.

Den vigtigste bremse er et enzym kaldet GPX4, som bruger glutathion til at reducere lipidperoxider til harmløse lipidalkoholer. Stoffer, der bruges til at udløse ferroptose i laboratoriet, angriber dette forsvar på bestemte steder. Erastin blokerer optagelsen af cystin gennem system xc-minus, hvilket fratager cellen cystein til glutathionsyntesen. Buthioninsulfoximin blokerer glutathionsyntesen direkte. RSL3 hæmmer selve GPX4. Alle tre medfører, at peroxider ikke fjernes, men de gør det på forskellige trin, så et resultat med ét udløsende stof kan ikke automatisk generaliseres til de andre.

Ferroptose adskiller sig fra apoptose ved de egenskaber, der definerer den. Der er ingen caspasekaskade og ingen apoptotiske legemer. Jernkelatorer som deferoxamin og radikalfangende stoffer som ferrostatin-1 undertrykker den, og det er den praktiske test, forskere bruger til at betegne en celledød som ferroptotisk snarere end blot nekrotisk. Det bredere overblik over regulerede celledødsprocesser sætter denne forskel i perspektiv, og cellernes håndtering af labilt jern forklarer, hvorfor kelatering er så afgørende en kontrol.

Hvor mitokondrier passer ind, og hvorfor det var omstridt

Tidlige studier rapporterede, at celler uden mitokondrielt DNA stadig gennemgår ferroptose, hvilket tydede på, at mitokondrier ikke er nødvendige. Senere studier fandt, at fjernelse af mitokondrier eller blokering af respirationen kan undertrykke ferroptose udløst af cysteinmangel, men ikke af direkte GPX4-hæmning. Begge resultater kan være korrekte, hvis mitokondriernes bidrag afhænger af den udløsende påvirkning, celletypen og stedet, hvor den afgørende peroxidation foregår.

Studiet, som denne artikel tager udgangspunkt i, undersøgte uenigheden med en probe, der er specifik for et bestemt cellekompartment. MitoCLox er en mitokondriemålrettet version af en reporter for lipidperoxidation: Den ændrer fluorescens, når den møder lipidperoxylradikaler inde i mitokondrierne. I fibroblaster behandlet med erastin optrådte oxidation af den mitokondrielle probe i stadig levende celler før celledøden, og den varierede mellem cellerne i populationen. Denne rækkefølge er vigtig. Peroxidation, der går forud for celledød, er en mulig årsag. Peroxidation, der kun måles i døde celler, er et restprodukt. En supplerende vejledning om analyser af lipidperoxidation og hvad de enkelte prober registrerer forklarer, hvorfor probens placering afgør, hvad et signal betyder.

Det samme mønster viste sig i en anden model. Fibroblaster fra en patient med Lebers hereditære optikusneuropati, som har en mutation i kompleks I og et højere grundniveau af oxidativt stress, døde ved ferroptose, når glutathion blev udtømt, mens kontrolfibroblasterne modstod påvirkningen. Igen kom oxidation af den mitokondrielle probe først. Detaljerne findes i fibroblaststudiet af mitokondriel lipidperoxidation ved ferroptose.

Hvad methylenblåt ændrede i disse forsøg

Methylenblåt er en redoxbærer. Dets oxiderede form modtager elektroner fra NADH-koblede reaktioner ved kompleks I, og dets reducerede form afgiver dem til cytokrom c, som leverer dem videre til kompleks IV. Det skaber en delvis omvej uden om den del af kæden, hvor elektroner normalt lækker til ilt og danner superoxid. Læsere, der ønsker det fulde billede af elektronoverførslen, bør begynde med hvordan methylenblåt flytter elektroner gennem mitokondrier.

I erastinbehandlede lungefibroblaster bevarede methylenblåt ved 250 nanomolar cellernes levedygtighed målt i en celleoverlevelsesanalyse, ligesom de mitokondriemålrettede antioxidanter SkQ1 og MitoTEMPO. Kontrollerne afgrænser konklusionen. Ferrostatin-1, alfa-tocopherol og deferoxamin beskyttede også, hvilket bekræfter, at celledøden var ferroptotisk. SkQ1-analogen uden en antioxidantgruppe beskyttede ikke, hvilket peger på redoxkemi snarere end uspecifik ophobning. Beskyttelsen aftog over cirka 200 nanomolar SkQ1, i overensstemmelse med quinonantioxidanters kendte prooxidative adfærd ved højere niveauer. Methylenblåt har den samme dobbelte dosisafhængige adfærd: beskyttende ved lave nanomolære niveauer i disse cellekulturer, men i stand til at danne hydrogenperoxid gennem redoxcykling ved højere koncentrationer eller kraftig belysning. Denne type dosiskontekst gennemgås i reaktive iltforbindelser i mitokondrier.

Forsøgene med isolerede mitokondrier adskilte derefter ROS-kilderne. Når divalent jern var til stede, stimulerede substrater, der leverer elektroner til kompleks I, sammen med rotenon oxidation af proben. Rotenon blokerer nedstrøms for flavinstedet, så bærerne opstrøms forbliver reducerede og lækker elektroner til ilt fra det flavin, der vender mod matrix. Substrater, der leverer elektroner til kompleks III, sammen med antimycin A producerede store mængder hydrogenperoxid, men drev ikke lipidperoxidation. Samme samlede ROS-signal, forskellig placering, forskelligt resultat. Både SkQ1 og methylenblåt undertrykte den kompleks I-drevne peroxidation uden at undertrykke selve produktionen af hydrogenperoxid, hvilket placerer deres virkning efter ROS-dannelsen, ved lipidperoxidationstrinnet.

Forsøgsdelen med jernoverbelastning og sporet fra lipofuscin

Et andet studie undersøgte spørgsmålet fra jernsiden. H9c2-kardiomyocytter, der blev udsat for submillimolære koncentrationer af ferriammoniumcitrat, udviklede mitokondrielle ROS, mitokondriel lipidperoxidation og derefter ferroptose, efterfulgt af ophobning af et lipofuscinlignende pigment inden for 24 timer. Lipofuscin er den autofluorescerende, jernholdige rest af oxiderede lipider og proteiner, der ophobes med alderen, og dets hurtige fremkomst her forbinder akut jerndrevet peroxidation med en klassisk aldringsmarkør. Både methylenblåt i nanomolære koncentrationer og SkQ1 forhindrede peroxidationen, celledøden og pigmentophobningen. Isolerede hjertemitokondrier bekræftede mønsteret: Rotenon sammen med divalent jern drev peroxidation og et pigmentlignende signal, og begge stoffer blokerede det. Hele forløbet er beskrevet i studiet af jernoverbelastning i H9c2-kardiomyocytter. Pigmentdelen af historien hører sammen med lipofuscin og markører for cellulær aldring.

Hvad analyser af celleoverlevelse ikke viser

En levedygtighedsmåling som CellTiterBlue viser, hvor mange celler i en dyrkningsskål der fortsat er metabolisk aktive efter en udløsende påvirkning og et muligt beskyttende stof. Det er en test af en mekanisme i et afgrænset system. Det er ikke et behandlingsresultat. Ingen af disse forsøg gav en patient en dosis, målte et sygdomsrelateret endepunkt eller fastlagde et terapeutisk vindue i en organisme.

Fire begrænsninger bør nævnes udtrykkeligt. For det første er udvalget af celletyper snævert: transformerede lungefibroblaster, primære hudfibroblaster, herunder én cellelinje med mitokondriel sygdom, og en kardiomyocytlinje fra rotter samt isolerede mitokondrier fra rottehjerter. Følsomheden varierede mellem linjerne, og LHON-linjen var valgt netop for sin usædvanlige sårbarhed. For det andet er de udløsende påvirkninger ekstreme laboratoriebetingelser: fuldstændig blokering af transport eller syntese samt jernbelastninger, som intet væv ville blive udsat for akut. For det tredje kan koncentration ikke omregnes ved simpel multiplikation. En nanomolær koncentration i dyrkningsmedium er ikke en dosis til mennesker, og methylenblåts fordeling, reduktion til dets farveløse form i blod og væv, lyseksponering og membranpotentiale er alle faktorer mellem en dyrkningsskål og et menneske. For det fjerde registrerer proberne forholdene i deres eget kompartment. Oxidation af MitoCLox viser, at der blev dannet mitokondrielle lipidradikaler; den viser ikke, at brud på plasmamembranen, som sandsynligvis er den afsluttende hændelse, blev forhindret direkte frem for undgået gennem et indgreb tidligere i forløbet.

Den redelige konklusion er derfor denne: I disse modeller driver ROS fra kompleks I sammen med jern mitokondriel lipidperoxidation, som går forud for ferroptose, og methylenblåt ved lave koncentrationer afbryder denne del af forløbet. Alt ud over denne del kræver andre forsøg i dyr og derefter i mennesker.