Hvorfor absorptionen af methylenblåt ændrer sig med koncentrationen

Tag en flaske stamopløsning af methylenblåt, og hæld op i to glas. Fyld det første med stamopløsningen og det andet med en tifold fortynding. Det andet glas er som forventet lysere. Se nøje efter, og du vil opdage, at noget andet også har ændret sig. Farvetonen er forskudt. Den ene opløsning hælder mod en klar himmelblå farve og den anden mod en blå farve med et violet skær. Fortyndingen gjorde mere end at reducere intensiteten. Den ændrede, hvilken kemisk form der står for størstedelen af absorptionen.

Princippet bag forskydningen er enkelt. Opløst methylenblåt findes ikke kun i én kemisk form. Den enkelte farvestofkation, kaldet monomeren, kan stable sig flade mod flade med en anden kation og danne en dimer, og dimerer kan vokse til større aggregater. Hver form har sit eget absorptionsspektrum. Det, et spektrofotometer registrerer, er summen af bidragene fra den blanding, der findes i den pågældende kuvette under de pågældende forhold. Ændr blandingen, og spektret forskydes, selv når det samlede farvestofindhold følger et enkelt fortyndingsforhold.

Monomerer og dimerer absorberer forskelligt

Forestil dig monomeren som et fladt kort med en positiv ladning fordelt over ringsystemet. To sådanne kort kan ligge flade mod flade. De positive ladninger frastøder hinanden, men de flade aromatiske overflader tiltrækker hinanden gennem stablingsinteraktioner, og det omgivende vand og modionerne afskærmer frastødningen. Resultatet er et bundet par med fælles elektroniske tilstande. Dets tilladte overgange ligger ved højere energi end monomerens overgang, så dimerbåndet optræder ved en kortere bølgelængde end monomerbåndet, mens større aggregater bidrager med en skulder længere mod den blå side.

Ved meget lav koncentration i rent vand dominerer monomerer, og båndet ved den lange bølgelængde er dominerende. Når den samlede koncentration stiger, udgør den parrede form en voksende andel, og båndet ved den kortere bølgelængde vokser i forhold til det første. Forholdet mellem de to bånd afspejler derfor blandingens sammensætning, ikke direkte den samlede koncentration. En måling ved en enkelt bølgelængde kan ikke skelne mellem de to uden en antagelse om, hvilken form der er til stede.

Derfor skal referencespektre altid ledsages af oplysninger om betingelserne. Spektralreferencen for methylenblåt angiver båndpositioner sammen med det opløsningsmiddel, den saltbaggrund, pH, temperatur og det koncentrationsinterval, de blev målt ved. Angives en top uden disse betingelser, er tallet utilstrækkeligt specificeret. To laboratorier kan begge have ret i deres angivelser af forskellige spektre for det samme farvestof, fordi de har målt forskellige blandinger.

Hvad forskyder ligevægten?

Koncentrationen er den vigtigste faktor. Dimerdannelse kræver, at to monomerer mødes, så dimerandelen stiger mere end lineært med det samlede farvestofindhold. Rapporterede dimeriseringskonstanter i vand ligger på flere tusinde pr. molar nær stuetemperatur, så dimerandelen stiger stejlt gennem det mikromolære område. En omfattende samlet modeltilpasning, der dækkede farvestofkoncentrationer fra mikromolært til millimolært niveau, fandt et tetramerbidrag forskelligt fra nul allerede under 34 mikromolar. Det advarer mod at stole på en model med strengt kun to kemiske former ved koncentrationer på nogle titals mikromolar. De præcise andele afhænger af mediet, og derfor beskriver denne artikel tendenser frem for at give en universel omregningstabel.

Salt er den anden faktor. Opløste ioner afskærmer frastødningen mellem to kationer, så tilsat natriumchlorid og lignende elektrolytter forskyder blandingen mod dimerer og aggregater ved samme farvestofkoncentration. Denne effekt ses i studier af aggregering af methylenblåt i saltvand og vandige medier, hvor farvestof fra omkring 1 mikromolar til 3.4 millimolar blev målt ved natriumchloridkoncentrationer fra 0 til 0.15 molar. I den modeltilpasning nåede tetramerandelen omkring 0.93 ved kombinationen af høj farvestofkoncentration og høj saltkoncentration. Et spektrum optaget i vand og et optaget i fysiologisk saltvand kan derfor ikke bruges som indbyrdes udskiftelige standarder.

Temperaturen trækker i den modsatte retning. Stabling frigiver bundet vand og modvirkes af termisk bevægelse, så opvarmning af en opløsning typisk får nogle dimerer til at dissociere til monomerer igen, mens afkøling fremmer association. Den tilpassede dissociationsentalpi er negativ, omkring minus 30 kilojoule pr. mol i intervallet 282 til 333 kelvin, hvilket bekræfter en exoterm association. En kold prøve, der måles umiddelbart efter at være taget ud af køleskabet, kan fremstå mere aggregeret end den samme prøve målt efter temperaturudligning til stuetemperatur.

Opløsningsmidlet fastlægger udgangspunktet. Vand fremmer med sin stærke hydrofobe effekt stabling af flade farvestofkationer. Alkoholer som ethanol og methanol solvatiserer ringene bedre og opløser aggregater, så farvestoffet ved samme koncentration fremstår mere monomert i ethanol end i vand. Aprotiske coopløsningsmidler gør det samme: I blandinger af vand og DMSO ved 293 kelvin hæmmede tilsat DMSO dimerisering, hvilket peger på vandets struktur som en drivkraft for stabling. Overfladeaktive stoffer kræver opmærksomhed i begge retninger. Over deres kritiske micellekoncentration kan miceller solubilisere monomerer enkeltvis og genskabe et monomerlignende spektrum. Under dette punkt kan et modsat ladet overfladeaktivt stof i stedet fremme stabling: Ved 100 mikromolar farvestof toppede SDS-drevet polymerisering nær 4 millimolar SDS, omtrent halvdelen af micellekoncentrationen, før en omfordeling ved højere koncentrationer af det overfladeaktive stof. Arbejde med effekter af farvestof-opløsningsmiddel-interaktioner og organiserede medier på spektre af methylenblåt illustrerer, hvor stærkt de umiddelbare molekylære omgivelser, og ikke kun den samlede koncentration, bestemmer de observerede bånd.

pH har især betydning ved yderpunkterne. I det næsten neutrale område, der bruges i det meste laboratoriearbejde, forbliver methylenblåt i sin velkendte kationiske blå form, og aggregering dominerer spektrets ændringer. Stærk syre eller base, redoxkemi, der danner den farveløse leukoform, eller binding til proteiner og partikler tilføjer hver især tilstande ud over monomer-dimer-parret. Når et spektrum ændrer sig efter tilsætning af en buffer, skal bufferens sammensætning undersøges for salt og bindende komponenter, før hele ændringen tilskrives pH alene. Referencen om kemi og protonering holder disse spørgsmål om kemisk identitet adskilt fra det spørgsmål om aggregering, der behandles her.

Hvorfor Beer-Lamberts rette linje bøjer

Beer-Lambert-relationen siger, at absorbans er lig med absorptivitet gange koncentration gange lysvejens længde. Det er en tællelov. Den forudsætter, at de objekter, der tælles, forbliver identiske, når deres antal ændres: én absorberende kemisk form, et fast spektrum, ingen koncentrationsafhængig kemi, monokromatisk målelys, ingen spredning eller genemission og lys, der faktisk gennemløber den angivne vej.

Aggregering bryder den første forudsætning. Formelt er den samlede absorbans stadig en sum over de kemiske former: lysvejens længde gange hver forms absorptivitet gange dens egen koncentration. Hver form følger loven. Det gør blandingen ikke, fordi koncentrationerne af de enkelte former er ikke-lineære funktioner af det samlede farvestofindhold. En kalibreringskurve, der viser absorbansen ved monomerbåndet som funktion af det samlede farvestofindhold, begynder derfor som en ret linje ved stærk fortynding og bøjer nedad, når koncentrationen stiger, fordi hver yderligere tilvækst tilfører forholdsmæssigt mindre monomer. En kurve målt ved dimerbåndet bøjer den modsatte vej. Arbejde med aggregering peger netop på denne mekanisme som årsagen til de observerede Lambert-Beer-afvigelser. Den klassiske fejl er at tilpasse en ret linje gennem det krumme område og ekstrapolere den. Linjen er kun gyldig inden for det interval og i den matrix, hvor den blev etableret.

Fortynding skaber en beslægtet faldgrube. Når en koncentreret stamopløsning fortyndes for at komme inden for instrumentets måleområde, bevares forholdet mellem de kemiske former ikke. Den fortyndede opløsning i kuvetten indstiller sig på en ny ligevægt med mere monomer, så dens spektrum beskriver den fortyndede prøve korrekt, men stamopløsningen forkert. Tilbageberegning af stamopløsningens spektrum ved at opskalere absorbansværdierne genskaber kun estimatet af det samlede indhold, hvis kalibreringen allerede tager højde for forskydningen. Det genskaber aldrig den oprindelige båndform. Enhver, der sammenligner et spektrum af et koncentrat med en fortyndet reference, sammenligner to forskellige blandinger.

Lysvejens længde er en del af resultatet

Absorbansen skalerer med den afstand, lyset bevæger sig gennem prøven. En 10 mm kuvette giver ti gange så høj absorbans som en 1 mm kuvette med den samme opløsning. Denne skalering er kun præcis for den samme opløsning, og aggregering gør dette forbehold afgørende.

I praksis er lysvejens længde et redskab til at holde sig inden for det gyldige område. En lang lysvej giver følsomhed for fortyndede, overvejende monomere opløsninger. En kort lysvej holder en koncentreret prøve inden for måleområdet uden et stort fortyndingstrin, der ville nulstille ligevægten. Det måleprogram for aggregering, som tallene ovenfor stammer fra, gjorde netop dette: 1 centimeter kuvetter til 1.1 til 34 mikromolar farvestof og 0.01 centimeter kuvetter til 94 mikromolar til 3.4 millimolar. Mikrovolumenplatforme og pladelæsere tilføjer deres egen geometri med korte og undertiden variable lysveje samt overflader, hvor kationisk farvestof kan adsorberes. Angiv lysvejens længde sammen med tallet, på samme måde som spektralreferencen angiver opløsningsmiddel og salt. En absorbans uden en lysvejslængde er ikke et resultat. Det er et rygte.

Mekanismen stiller krav til måleproceduren. Lad prøverne nå samme temperatur før måling. Brug samme kuvettetype og orientering, tilpassede blindprøver med samme salt- og bufferbaggrund samt rent laboratorieglas, fordi methylenblåt adsorberer til glas og plast, og en farvet kuvette bærer spor af den seneste koncentrerede prøve. Mål hurtigt efter klargøring, når aggregeringskinetikken har betydning, og opbyg hver kalibreringskurve i samme matrix og med samme lysvejslængde som prøverne med ukendt koncentration. Ved visuelle kontroller skal du huske, at øjet er et dårligt spektrometer. Hvorvidt opløsningens farve kan fastslå renhed er et særskilt spørgsmål med et negativt svar, og farvetoneforskydninger fra aggregering er en af grundene.

Et diagram til at have ved siden af instrumentet

Figuren nedenfor samler artiklen i én reference til laboratoriebordet. Tre opløsninger indeholder det samme farvestof, men har forskellig samlet koncentration og saltbaggrund. Deres skematiske spektre viser, hvordan monomerbåndet ved den lange bølgelængde mister andel til dimerbåndet ved den kortere bølgelængde, når stablingen øges. Betingelserne er angivet på figuren, fordi kurverne ikke kan genbruges uden dem. Brug spektralreferencen til målte båndpositioner under angivne betingelser. Se celleoptagelse gennem reduktion og fordeling for at læse om, hvordan farvestoffet trænger ind i celler, når det er i opløsning. Se lyseksponering og målegeometri for at læse om, hvordan lysdosis og geometri yderligere påvirker fotokemiske måleresultater.

Hovedreglen har to dele. Spektret identificerer den blanding, der findes i kuvetten under de angivne betingelser. Kun en kalibrering opbygget under de samme betingelser kan omsætte en absorbans til en samlet koncentration.