Alternativer til methylenblåt til mikroskopi

Til et simpelt bakterieudstryg kan krystalviolet erstatte methylenblåt, når formålet er at se cellernes form. For levende celler kan et bedre alternativ være fasekontrast helt uden farvning. Valget afhænger af den observation, du skal foretage.

Forestil dig, at to personer undersøger den samme bakteriekultur. Den ene vil skelne stave fra runde celler. Den anden vil vide, om en behandling har dræbt bakterierne. En farvning, der giver den første person et tydeligt billede, giver måske ikke den anden person et brugbart svar.

Før du vælger en erstatning, skal du færdiggøre denne sætning: “Jeg skal observere ___ i ___, og cellerne skal / behøver ikke at forblive levende.” Den sætning definerer den opgave, farvningen skal løse.

Start med prøven og spørgsmålet

Afgør først, om cellerne skal forblive levende, og identificér derefter den egenskab, du skal observere:

Cellerne skal forblive levende: Ved bevægelse eller form kan du overveje ufarvet fasekontrast eller DIC; ved nukleært DNA kan du overveje Hoechst 33342 med fluorescens; ved membranintegritet skal du vælge en valideret analyse såsom SYTO 9 med propidiumiodid.
Cellerne behøver ikke at forblive levende: Ved bakteriel morfologi kan du overveje en simpel farvning med krystalviolet eller negativ farvning med nigrosin; ved Gram-reaktion skal du bruge den komplette Gram-farvningsmetode; ved nukleært DNA i fikserede celler kan du overveje DAPI-fluorescens.

Brug denne tabel til at sammenligne begrænsningerne ved hver gren. Dette er valg af metode, ikke instruktioner til at udskifte flasker i en eksisterende protokol.

Hvad du skal observere	Prøve og udstyr	Muligt alternativ	Vigtigste begrænsning
Bakteriers form og placering	Forberedt bakterieudstryg; lysfelt	Simpel farvning med krystalviolet	Viser morfologi; fastslår ikke Gram-reaktion eller levedygtighed.
Cellekonturer mod en mørk baggrund	Bakteriologisk præparat; lysfelt	Negativ farvning med nigrosin	Præparation og formulering har betydning; en ufarvet celle er ikke nødvendigvis levende.
Gram-reaktion	Forberedt bakterieudstryg; lysfelt	Komplet Gram-farvningsmetode	Kræver hele reagenssekvensen og kontroller.
Bevægelse eller ændringer i levende celler	Kompatibelt vådpræparat; fasekontrast eller DIC	Ingen farvning	Kræver egnet optik; kontrast identificerer ikke et molekyle.
Nukleært DNA	Fikserede celler; fluorescens	DAPI	Kræver kompatible excitations- og emissionsfiltre.
Nukleært DNA i levende celler	Levende celler; fluorescens	Hoechst 33342	Celleoptagelse dokumenterer ikke, at billeddannelsesforholdene er uskadelige.
Bakteriel membranintegritet	Ufikserede bakterier; fluorescens	SYTO 9 med propidiumiodid	Membranfarvning er et indirekte mål for levedygtighed.

Ved et simpelt udstryg skal metoden erstattes med omtanke

Krystalviolet er en praktisk kandidat, når opgaven er at få et ensfarvet billede af bakteriel morfologi. FDA's Bacteriological Analytical Manual angiver to formuleringer med krystalviolet, der er egnede til simpel farvning. Brug en dokumenteret formulering og den tilhørende fremstillingsmetode; farvestoffets navn alene specificerer ikke et brugsklart reagens.

Krystalviolet indgår også i Gram-farvning, men det gør ikke en simpel farvning med krystalviolet til en Gram-farvning. I ASM's Gram-farvningsprotokol afhænger det differentielle resultat af, at krystalviolet, jod, affarvning og kontrastfarvning virker i rækkefølge. Hvis disse trin udelades, ændres det, som billedet kan dokumentere. Se simpel farvning kontra Gram-farvning for denne forskel.

Nigrosin giver en anden måde at synliggøre konturer på: Det gør baggrunden mørk, mens bakteriecellerne forbliver forholdsvis lyse. Der er en nyttig detalje i Mercks instruktioner til nigrosin, som en generel liste over alternativer kan overse. Den angivne arbejdsformulering indeholder formaldehyd. Du kan derfor ikke udlede kompatibilitet med levende celler ud fra ordene “negativ farvning”, selv om cellerne selv ser ufarvede ud. Kontrollér den komplette formulering og prøveforberedelsen.

Ved levende prøver bør du overveje at ændre optikken

Hvis du vil observere celler bevæge sig eller dele sig, kan tilføjelsen af endnu et farvestof komplicere observationen. Som Nikon forklarer i sin vejledning om kontrast i transparente prøver, gør fasekontrast og differentialinterferenskontrast, eller DIC, prøver synlige gennem forskelle i deres optiske egenskaber. De kan synliggøre levende, ufarvede celler, forudsat at mikroskopet har de nødvendige komponenter.

Dette valg bevarer et ufarvet præparat, men ændrer de tilgængelige oplysninger. Du kan følge en afgrænsning eller en bevægelse uden at vide, hvilket molekyle der skabte kontrasten. Hvis spørgsmålet handler om molekylær lokalisering, skal du i stedet vælge en passende mærkningsmetode.

For nukleært DNA skelner Invitrogens sammenligning af DAPI- og Hoechst-farvninger mellem DAPI's almindelige anvendelse med fikserede celler og det mere cellepermeable Hoechst 33342, som foretrækkes til mærkning af levende celler. Begge kræver fluorescensudstyr. Ingen af dem er en direkte erstatning for en farvet lysfeltfarvning.

Behandl eksponering for farvestof og belysning som forsøgsbetingelser. Sammenlign farvede og ufarvede præparater, når cellernes adfærd er det, du måler.

En rød celle er ikke automatisk en død celle

SYTO 9 og propidiumiodid bruges ofte sammen til at vurdere bakteriel membranintegritet. BacLight-manualen forbinder intakte membraner med grøn farvning og beskadigede membraner med rød farvning. Denne fortolkning skal valideres for den pågældende prøve.

Et studie fra 2019 af Rosenberg og kolleger illustrerer problemet. I 24-timers E. coli-biofilm på glas i fosfatbufferet saltvand fremstod omkring 96% af cellerne som propidiumiodid-positive in situ. Alligevel vurderede forfatterne, at 82% kunne dyrkes efter høst. Konfokale billeder viste celler med grønt indre under rødfarvet materiale, hvilket pegede på ekstracellulære nukleinsyrer som årsag til det misvisende signal.

Disse procenttal beskriver forskellige målinger på studiets præparater, ikke en universel korrektionsfaktor. Den nyttige lære er at undersøge, hvad der genererede signalet. I en biofilm kan et nukleinsyrefarvestof registrere materiale uden for cellerne såvel som inde i beskadigede celler. Ved en konklusion om levedygtighed anbefaler forskerne supplerende målinger, såsom dyrkning eller metabolisk aktivitet, samtidig med at de anerkender, at hver metode har begrænsninger.

Kontrollér, hvad alternativet faktisk indeholder

En alternativ farvningsmetode kan stadig indeholde methylenblåt. Giemsa er et eksempel: Merck beskriver sit produkt som en azure-eosin-methylene-blue-opløsning, beregnet til anvendelser, herunder blod- og knoglemarvsudstryg. Det kan være en anden metode til en anden prøve, men det opfylder ikke et krav om at udelukke methylenblåt.

Hvis udelukkelse af en forbindelse er en del af forsøget, skal du kontrollere reagensets identitet og formulering, før du sammenligner billeder. Vejledningen om methyl blue, methylenblåt og farvestoffer med lignende navne gennemgår forskellene i navngivning.

Verificér substitutionen, før resultatet bruges

Ved en ny metode skal du foretage en mindre sammenligning med repræsentative prøver og en passende kontrol. Hold mikroskopindstillingerne sammenlignelige, hvor det er muligt. Registrér reagensformulering, prøveforberedelse, eksponering og billeddannelsesforhold, så et billede, der ser bedre ud, kan undersøges frem for blot at blive foretrukket.

Vurder resultatet i forhold til det oprindelige spørgsmål. Ved morfologi skal du vurdere, om cellegrænser og placering fortsat kan fortolkes. Ved nukleær mærkning skal du vurdere signalets placering og baggrunden. Ved levedygtighed skal du kræve evidens ud over en visuelt tiltalende farveadskillelse. Den bredere vejledning om farvning med methylenblåt og laboratorieanvendelser forklarer, hvordan observation og præparation hænger sammen.

Vælg det alternativ, der bevarer den måling, du har brug for. Farve er kun én egenskab ved det resulterende billede.