Paul Ehrlich a glas methylen: yr arbrofion â llifynnau

Nid cyffur oedd cyfraniad Paul Ehrlich i feddygaeth. Dadl am sut i edrych ar un ydoedd.

Yn 1878 cyflwynodd draethawd doethuriaeth yr oedd ei adran agoriadol yn dwyn y teitl "Y Cysyniad Cemegol o Staenio." Ei ddadl oedd bod staenio toriad o feinwe a lliwio darn o frethyn yn dilyn yr un rhesymeg. Yn y ddau achos, mae lliw yn glynu oherwydd affinedd cemegol rhwng y llifyn a'r defnydd, nid oherwydd bod y feinwe'n amsugnol, yn seimllyd, neu wedi'i siapio i ddal pigment. Roedd Ehrlich wedi tyfu i fyny yn gwylio ei gefnder, y patholegydd Karl Weigert, yn paratoi toriadau wedi'u staenio, a'r hyn a ddaliodd ei sylw oedd nid y delweddau ond y ffaith bod y llifyn yn dewis ble i fynd.

Mae'r honiad yn swnio'n ddiymhongar. Nid felly y mae. Os yw llifyn yn rhwymo wrth feinwe am resymau cemegol, yna mae patrwm y staenio yn adroddiad ar gemeg y feinwe honno. Nid darlun yn unig yw sleid wedi'i staenio mwyach: mae'n fesuriad.

Adeiladodd ar hynny ar unwaith. Yn 1880 cyfunodd las methylen â ffwcsin asid a galw'r cymysgedd yn staen niwtral, yn gorff lliwio niwtral, a oedd yn gwahanu'r gwahanol fathau o gelloedd gwaed gwyn lle na allai'r llifynnau unigol a ddefnyddid ar y pryd wneud hynny. Ddwy flynedd yn ddiweddarach cyflwynodd ddull fioled methyl ar gyfer staenio basilau twbercwlaidd, a mabwysiadodd Koch y weithdrefn yn ei waith ei hun.

Mae'r ddamcaniaeth a roddodd sylfaen gyffredin i'r arferion hyn yn ddiweddarach yn fater ar wahân, ac mae ei dyddiad yn cael ei symleiddio'n rheolaidd. Mae damcaniaeth cadwyn ochr Ehrlich, y syniad bod sylwedd yn gweithredu ar gell oherwydd bod y ddau'n gemegol gydnaws, yn perthyn i'r 1890au, nid i flynyddoedd y llifynnau. Yr hyn a ddarparodd y gwaith cynharach oedd yr argyhoeddiad blaenorol: mae detholusrwydd yn gemegol, ac felly gellir chwilio amdano yn hytrach na dod ar ei draws ar hap.

Yr arbrawf a drodd y llifyn yn fap

Yn 1885 cyhoeddodd Ehrlich fonograff ar ofynion ocsigen yr organeb, gydag is-deitl yn ei ddisgrifio fel astudiaeth dadansoddi lliw. Ei ddull oedd chwistrellu llifynnau y mae eu lliw yn dibynnu ar eu cyflwr ocsidiad, ac yna cymharu sut roedd gwahanol organau yn eu rhydwytho neu'n eu cadw fel yr oeddent. Roedd y llifyn yn cael ei ddefnyddio fel offeryn, yn yr un modd ag y defnyddir thermomedr: roedd yn adrodd ar amodau y tu mewn i feinwe na ellid eu harchwilio'n uniongyrchol. Yn ôl datganiad Ehrlich ei hun, y nod oedd pennu pŵer rhydwytho organau byw gyda chymorth llifynnau penodol.

Daeth y canlyniad glas methylen yn 1886, mewn papur ar adwaith y llifyn â sylwedd nerfol byw, a ddarllenwyd i gymdeithas feddygol y mis Rhagfyr blaenorol. Cyflwynwyd glas methylen i gylchrediad gwaed anifail byw, ac yna tynnwyd tafelli tenau o feinwe a'u hamlygu i'r aer fel bod y llifyn di-liw a oedd wedi cronni yn ocsidio yn ôl i las ac yn dangos ble roedd wedi ymgasglu. Cymerodd celloedd nerfol a ffibrau nerfol y lliw, ac fe wnaethant hynny'n ddigon detholus i'r dechneg ddod yn ddull safonol o ddangos meinwe nerfol. Nid deunydd lliwio wedi'i roi ar doriad marw ar fainc yn unig oedd y cyfansoddyn mwyach. Roedd yn farciwr a oedd yn dosbarthu ei hun y tu mewn i gorff byw, ac roedd modd darllen y dosbarthiad hwnnw.

Mae angen datgan yn glir y briodwedd sy'n sail i'r ddau arbrawf, oherwydd bod popeth arall yn y stori hon yn dibynnu arni. Mae glas methylen yn gildroadwy. Mae ei ffurf rydwythiedig, lewco-las methylen, yn ddi-liw, ac wrth ddod i gysylltiad ag ocsigen mae'n dychwelyd i'r catïon glas. Mae hydoddiant glwcos o'r llifyn mewn jar wedi'i selio yn ddi-liw; agorwch y jar ac mae'n troi'n las. Dywedir bod Ehrlich wedi dangos hyn yn uniongyrchol drwy drin toriadau wedi'u staenio â chlorid haearn yn ogystal ag aer a gwylio'r lliw yn dychwelyd. Mae llifyn sy'n newid lliw gyda chyflwr rhydocs ei amgylchoedd yn chwiliedydd ar gyfer yr amgylchoedd hynny.

Felly roedd dwy briodwedd ochr yn ochr. Gallai llifyn wahaniaethu rhwng un feinwe ac un arall. A gellid troi llifyn ymlaen ac i ffwrdd drwy newid ei gyflwr ocsidiad.

O edrych yn ôl, yr ail briodwedd yw dechrau cemotherapi. Os yw cyfansoddyn yn rhwymo wrth un math o feinwe ac nid wrth un arall, yna gallai'r un cyfansoddyn gyrraedd un math o organeb ac nid un arall. Datganodd Ehrlich y casgliad yn uniongyrchol: pe gellid staenio pathogen yn ddetholus, gallai'r staenio ddangos niwed penodol i'r pathogen hwnnw. Felly gallai llifyn fod yn ddefnyddiadwy fel cyffur, wedi'i anelu at oresgynnwr yn hytrach nag at y claf.

Nid ar gyfer malaria oedd y prawf cyntaf mewn claf. Yn 1890, gyda'r seiciatrydd Arthur Leppmann, adroddodd Ehrlich fod glas methylen yn lleddfu poen mewn cyflyrau niwralgig a rhewmatig yn y cyhyrau, y cymalau a'r tendonau. Trafododd y ddau a allai'r cyffur weithredu ar salwch meddwl a phenderfynwyd peidio â rhoi cynnig arno. Aeth meddyg Eidalaidd, Pietro Bodoni o Genoa, ymlaen beth bynnag. Mae teitl ei bapur o 1899 yn cyfeirio at weithred dawelyddol mewn gwahanol ffurfiau ar seicosis: disgrifiodd dawelu pedwar ar ddeg o gleifion cynhyrfus, a nododd fod meddygon eraill yn Genoa eisoes yn defnyddio'r llifyn at yr un diben. Nid yw tawelyddu yn effaith ar y salwch, ac mae'r gwahaniaeth hwn yn codi dro ar ôl tro yn yr hanes hwn.

Daeth y gwaith ar falaria yn 1891, gyda'r patholegydd Paul Guttmann, yn ysbyty Moabit yn Berlin. Rhoddwyd glas methylen i ddau glaf, ac ymddangosodd yr adroddiad yn y Berliner klinische Wochenschrift ar 28 Medi 1891. Yn yr achos cyntaf cymerodd y claf 0.5 g o'r llifyn ar unwaith ar noson 29 Mehefin; ni ddaeth y pwl a ddisgwylid yn llawn, a'r unig gŵyn a gofnodwyd wedyn oedd strangwria ysgafn gydag wrin glas. Diflannodd pyliau o dwymyn dros y dyddiau cyntaf, ac roedd y parasitiaid wedi diflannu o'r gwaed erbyn yr wythfed diwrnod fan bellaf. Crynodeb yr awduron eu hunain oedd bod eu disgwyliadau wedi'u cyflawni'n llwyr. Nid yw dau achos heb reolaeth yn brawf. Mae'r drafodaeth lawnach ar las methylen a malaria, gan gynnwys y treialon modern, yn perthyn ar ei thudalen ei hun, ac mae'r cwestiwn diddorol yma'n fwy penodol: faint o resymeg Ehrlich a oroesodd gysylltiad â'r parasit.

Lle daliodd y rhesymeg a lle methodd

Ni oroesodd llawer o'r mecanwaith, o leiaf nid yn y ffurf a gynigiodd Ehrlich. Nid yw'r fersiwn daclus, lle mae catïon trichylchol gwastad yn llithro rhwng parau basau DNA y parasit, yn dal dŵr yn achos Plasmodium. Mae glas methylen yn cael ei rydwytho mor rhwydd gan gell waed goch heintiedig fel nad yw byth yn cyrraedd y parasit fel catïon planar o gwbl, ac nid yw'r esboniad mewnosod sy'n addas i'r llifynnau acridin yn addas i hwn.

Mae'r hyn y mae'r dystiolaeth yn ei gefnogi yn llai taclus. Mae glas methylen yn atal gweithrediad glwtathion rhydwctas y parasit ar grynodiadau y gall claf eu cyrraedd. Mae'n rhwystro trosi haem yn haemozoin, y pigment anadweithiol y mae'r parasit yn ei greu i osgoi cael ei wenwyno gan ei dreuliad ei hun o haemoglobin, tua mor effeithiol â chlorocwin ac yn llawer mwy effeithiol na chwinîn. Mae ei gylchred rhydocs hefyd yn cynhyrchu rhywogaethau ocsigen adweithiol mewn cell sydd eisoes yn eu cynhyrchu. Nid yw wedi'i benderfynu eto pa un o'r rhain yw'r gwir fecanwaith, nac a ydynt i gyd yn cyfrannu.

Mae cymhlethdod pellach, a dylai lywio'r ffordd y darllenir unrhyw honiad hanesyddol am y cyfansoddyn hwn. Nid un sylwedd oedd glas methylen masnachol y cyfnod hwnnw. Roedd samplau'n cynnwys Azure B, y cyfansoddyn perthynol mono-ddemethyliedig, ac roedd mwy ohono'n cronni mewn hydoddiannau hŷn. Mae Azure B yn llifyn metacromatig gyda thargedau gwahanol: mae'n staenio DNA dwy edefyn yn las dwfn ac RNA yn wyrdd. Ni all cymysgedd o ddau lifyn â chyrchfannau gwahanol, mewn cyfrannau na chofnododd neb, gynnal datganiad clir am yr hyn a wnaeth y glas methylen ynddo.

Ni ddisodlodd y llifyn ei hun chwinîn erioed. Gwnaeth y dull yn well. Parhaodd Wilhelm Roehl, myfyriwr Ehrlich a oedd yn gweithio i'r grŵp llifynnau a chyffuriau IG Farben, i hyrwyddo deilliadau llifynnau fel meddyginiaethau trofannol a darparodd yr offeryn a oedd ar goll: y caneri, wedi'i heintio â malaria adar, fel prawf sgrinio arferol ar gyfer darpar gyfansoddion. Yna newidiodd Werner Schulemann y gadwyn ochr, a gwnaeth yr halen ffenothiasiniwm a ddeilliodd o hynny wella'r haint arbrofol. Roedd yn dal i droi cleifion yn las.

Yn y pen draw, nid y llifyn na'r system gylchoedd ond y gadwyn ochr oedd y canlyniad parhaol. Newidiodd ychwanegu grŵp dialcylaminoalcylamino ymddygiad y moleciwl, a goroesodd y darn hwnnw bob ailgynllunio diweddarach. Cadwch y grŵp hwnnw a chyfnewid y cylch ffenothiasiniwm am acridin, a'r canlyniad yw cwinacrin. Cyfnewidiwch ef am gwinolin, a'r canlyniad yw chlorocwin. Mae pamacwin, primacwin ac amodiacwin, sydd i gyd yn dal yn y catalog gwrthfalaria, yn cynnwys yr un grŵp. Darparodd y cyfansoddyn a fethodd fel triniaeth y darn a lwyddodd.

Mae'r cysylltiad â'r cyffuriau gwrthseicotig yn mynd drwy'r cylch yn hytrach na thrwy'r cyffur. Egluro strwythur glas methylen a arweiniodd Heinrich August Bernthsen at y cnewyllyn ffenothiasin sylfaenol yn 1883, a'r sgaffald hwnnw, gyda gwahanol amnewidiadau, oedd yr hyn yr oedd cemegwyr yn Rhône-Poulenc yn gweithio arno yn y 1940au wrth chwilio am wrthhistaminau. Syntheseiddiwyd un o'r cyfansoddion hynny tua diwedd 1950 a'i brofi gan y llawfeddyg Henri Laborit, a sylwodd ei fod yn gadael cleifion yn dawel a difater. Daeth yr adroddiad cyhoeddedig cyntaf am ei ddefnydd seiciatrig, mewn claf â mania, ym mis Ionawr 1952. Nid disgynnydd cyffur gwrthfalaria Ehrlich yw'r cyffur gwrthseicotig cyntaf gymaint â pherthynas bell i'r llifyn y dechreuodd ag ef.

Tri arfer o'r hanes hwn sy'n werth eu cadw

Mae "Y cyffur synthetig cyntaf a ddefnyddiwyd mewn meddygaeth" yn disgrifio categori, ac mae'r amodau'n ehangach nag y mae'r ymadrodd yn ei awgrymu. Mae'r ymadrodd wedi dod yn un sefydlog; mae adolygiad gan Schirmer a'i gydweithwyr y cyfeirir ato'n aml yn Neurobiology of Aging yn galw glas methylen y cyffur cwbl synthetig cyntaf erioed a ddefnyddiwyd mewn meddygaeth. Cyflwynwyd hydrad cloral fel tawelydd synthetig yn 1869, fwy nag ugain mlynedd ynghynt. Mae papur 1891 ei hun yn darparu rhan o'r ateb, oherwydd bod ei awduron yn enwi'r cyffuriau synthetig gostwng twymyn a oedd eisoes wedi methu yn erbyn malaria, gan gynnwys cwinolin, antipyrin ac antifebrin. Daeth cyfansoddyn arsenig Ehrlich ei hun ar gyfer syffilis yn ddiweddarach fyth. Mae'r fersiwn o'r honiad y gellir ei hamddiffyn yn ymwneud â'r dull yn hytrach na phwy oedd gyntaf: mae glas methylen ymhlith y cyfansoddion synthetig cynharaf a ddewiswyd i weithredu yn erbyn organeb benodol ar sail damcaniaeth gemegol am ddetholusrwydd.
Nid yw dosbarthiad detholus yn golygu budd detholus. Canlyniad Ehrlich yn 1886 oedd bod y llifyn yn mynd i feinwe nerfol. Mae ble mae cyfansoddyn yn mynd a beth mae'n ei wneud ar ôl cyrraedd yn ddau fesuriad gwahanol, ac mae'r cyntaf yn llawer haws i'w wneud. Yn y bwlch hwnnw y mae'r rhan fwyaf o honiadau am las methylen a'r ymennydd wedi bod byth ers hynny.
Mae purdeb yn perthyn i'r dystiolaeth, nid i'r marchnata. Mae'r cofnod hanesyddol yn amwys am yr union reswm hwn. Mae gwahaniaethau bach mewn strwythur yn newid ble mae'r cyfansoddyn hwn yn mynd, a dyna pam mae'n rhaid cysylltu tystysgrif dadansoddi â swp penodol yn hytrach na'i chynnig fel datganiad bod cynnyrch wedi'i brofi. Mae gwerthwr sy'n honni cydymffurfiaeth â'r monograff ffarmacopoeaidd ond yn profi metelau trwm yn unig yn honni mwy nag y mae'r adroddiad yn ei gefnogi. Mae Blupreme yn cael glas methylen gan wneuthurwr fferyllol ac yn profi'r fanyleb lawn a nodir yn y monograff: hunaniaeth, purdeb, amhureddau organig, toddyddion gweddilliol, amhureddau elfennol, gweddillion ar ôl tanio, terfynau microbaidd ac endotocsinau bacteriol. Cyhoeddir yr adroddiad ochr yn ochr â'r cynnyrch, ac mae'r dudalen glas methylen gradd USP yn egluro'r terfynau hynny a pham mai canlyniad Azure B yw'r un cyntaf i chwilio amdano.

Trywydd ffynonellau â dyddiadau

Dyddiad	Beth a wnaed	Ble mae wedi'i gofnodi
1878	Mae traethawd doethuriaeth yn dadlau bod staenio a lliwio tecstilau yn dilyn yr un rhesymeg o affinedd cemegol	Ehrlich, traethawd, Leipzig, 1878; teitl ei ran gyntaf yw "Y Cysyniad Cemegol o Staenio"
1880	Mae glas methylen gyda ffwcsin asid, "staen niwtral", yn gwahanu'r mathau o gelloedd gwaed gwyn	Krafts, Hempelmann a Skórska-Stania, Parasitol Res 111:1-6, 2012
1882	Cyflwynir dull fioled methyl ar gyfer staenio basilau twbercwlaidd i Gymdeithas Feddygol Berlin, a chaiff ei gyhoeddi'r flwyddyn ganlynol	Ehrlich, Berliner klinische Wochenschrift 20:13, 1883
1885	Mae monograff dadansoddi lliw yn defnyddio llifynnau rhydocs i gymharu pŵer rhydwytho organau	Ehrlich, Das Sauerstoff-Bedürfniss des Organismus, Berlin, 1885
1886	Mae glas methylen wedi'i chwistrellu i anifail byw yn marcio meinwe nerfol yn ddetholus	Ehrlich, "Ar adwaith glas methylen â sylwedd nerfol byw", Deutsche Medizinische Wochenschrift 12(4):49-52, 1886
1888	Mae glas methylen gydag eosin yn staenio'r parasit malaria mewn ffilmiau gwaed	Chęciński, Centralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde 3(15):457-460, 1888
1890	Adroddir bod glas methylen yn lleddfu poen niwralgig a rhewmatig	Ehrlich a Leppmann, Deutsche Medizinische Wochenschrift 16(23):493-494, 1890
1891	Rhoddir glas methylen i ddau glaf â malaria yn ysbyty Moabit, Berlin	Guttmann ac Ehrlich, "Ar weithred glas methylen mewn malaria", Berliner klinische Wochenschrift 28(39):953-956
1897	Amlinellir y ddamcaniaeth cadwyn ochr yn ei ffurf aeddfed, mewn papur ar serwm difftheria	Ehrlich, Klinisches Jahrbuch 6:299-326, 1897
1899	Adroddir am weithred dawelyddol glas methylen mewn gwahanol ffurfiau ar seicosis	Bodoni, Clinica Medica Italiana 24:217-222, 1899
1926	Daw'r caneri heintiedig yn brawf sgrinio gwrthfalaria arferol	Roehl, Deutsche Medizinische Wochenschrift 52, 1926
1932	Mae amnewidiad yn y gadwyn ochr yn gwella'r haint arbrofol	Schulemann, Proc R Soc Med 25:897-905, 1932
1934	Amnewidir cylch acridin am gwinolin, gan gynhyrchu chlorocwin	Krafts a'i gydweithwyr, 2012, gan ddefnyddio deunydd o archif Bayer
1950	Syntheseiddir ffenothiasin ag amnewidiadau arno, a enwir yn ddiweddarach yn glorpromasin, yn Rhône-Poulenc; cyhoeddir hyn yn 1952	Charpentier a'i gydweithwyr, Comptes rendus de l'Académie des Sciences 235:59-60, 1952
1952	Yr adroddiad cyhoeddedig cyntaf am ddefnydd seiciatrig clorpromasin	Delay, Deniker a Harl, Annales médico-psychologiques 110:112-117, 1952

Mae'r gyfres ddyddiedig o gerrig milltir, gan gynnwys cemeg y llifynnau a ddaeth cyn Ehrlich a'r graddau a'r manylebau a ddaeth ar ei ôl, wedi'i hamlinellu ar wahân yn hanes glas methylen, ac ymdrinnir â hunaniaeth y cyfansoddyn ei hun yn beth yw glas methylen.

Nid yw'r platiau sy'n sail i'r hanes hwn, a atgynhyrchwyd yn adolygiad 2012 gan Krafts, Hempelmann a Skórska-Stania, yn gyfwerth, ac mae un enghraifft yn dangos pam. Plât 1891 yw prif gofnod y treial; mae portread 1910 wrth ei ochr yn rhoi dyddiad i enw da a dim byd arall. Mae tudalennau o lyfr nodiadau Andersag o 1934 yn olion uniongyrchol yr amnewid â chwinolin, yn llawysgrifen y cemegydd ei hun.

Y crynodeb gonest o arbrofion Ehrlich â llifynnau yw iddo gael y detholusrwydd a'r targed yn iawn, ond y mecanwaith yn anghywir. Mae glas methylen yn crynhoi mewn meinwe nerfol ac yn niweidio'r parasit malaria. Nid yw'n gwneud yr ail oherwydd y cyntaf, ac roedd y rheswm cemegol a gynigiodd am y ddau yn anghywir. Roedd yr hyn a ddangosodd y tu hwnt i amheuaeth yn fwy parhaol na mecanwaith cywir: gellir dewis cyfansoddyn yn hytrach na dod o hyd iddo, a'i ddewis ar sail tystiolaeth a gasglwyd cyn i neb ei roi i glaf.