Sut mae glas methylen yn mynd i mewn i gelloedd: rhydwytho, ailocsidio, mewnlifiad

Wrth wylio dysgl o gelloedd endothelaidd yn cymryd glas methylen i mewn, mae'r dehongliad amlwg hefyd yn anghywir. Mae'r cyfrwng yn colli ei liw glas, ac mae'r celloedd yn ennill gronynnau glas, felly mae'n rhaid bod y llifyn wedi croesi'r bilen fel y moleciwl glas. Mae'r arbrofion yn dweud fel arall. Prin y mae'r ffurf las yn croesi. Y ffurf ddi-liw sy'n croesi, ac mae'r glas a welwch y tu mewn yn cael ei greu y tu mewn, ar ôl cyrraedd.

Mae'r gwrthdroad hwn yn bwysig oherwydd ei fod yn pennu beth y gall staenio ei ddweud wrthych a beth na all ei ddweud. Mae gronynnau glas yn dangos llifyn ocsidiedig sydd wedi'i ailocsidio a'i ddal mewn organynnau. Nid ydynt yn dangos cyfanswm y llifyn yn y gell, nid ydynt yn dangos y gronfa rydwythiedig, ac nid ydynt yn mesur effaith fiolegol. I weld pam, dilynwch y tri cham: rhydwytho ar yr arwyneb, trylediad y ffurf rydwythiedig, ac ailocsidio a dal y tu mewn.

Mae'r ddwy ffurf yn ymddwyn fel moleciwlau gwahanol

Mae glas methylen ocsidiedig yn system gylchoedd wastad sydd â gwefr bositif. Mae'n hydoddi mewn dŵr, yn amsugno golau'n gryf tua 600 i 700 nanometr, ac yn edrych yn las. Y wefr yw'r pwynt allweddol. Nid yw moleciwl â gwefr sy'n hoff o ddŵr yn llithro'n hawdd drwy bilen lipid, felly'r ymadrodd gofalus yn y llenyddiaeth yw cymharol anathraidd drwy bilenni, nid anathraidd.

Mae glas methylen rhydwythiedig, a elwir yn lewcoglas methylen, yn ddi-liw, heb wefr, ac yn hydawdd mewn braster. Tynnwch y wefr ac mae'r bilen yn peidio â bod yn wal. Mae'r moleciwl rhydwythiedig yn tryledu ar draws yn rhwydd, ac unwaith y bydd y tu mewn i adran sy'n fwy ocsidiol gall golli electronau eto a dychwelyd i'r ffurf las, â gwefr, sydd wedi'i dal. Felly mae cemeg rhydocs y llifyn hefyd yn fecanwaith ei gludiant. Newidiwch nifer yr electronau ac rydych yn newid yr athreiddedd.

Daw'r electronau ar gyfer y cam cyntaf o'r gell ei hun. Mae celloedd mamaliaid yn cludo electronau ar draws y bilen blasma, gan symud cywerthoedd rhydwytho o roddwyr mewngellol tuag allan at dderbynyddion ar yr arwyneb. Mae'r gweithgarwch hwn ar draws y bilen blasma yn swyddogaeth arferol i gelloedd, a geir yn y rhan fwyaf o fathau o gelloedd. Mae'r rhydwctas ar yr arwyneb endothelaidd sy'n trin llifynnau thiasin yn ymddwyn fel rhai eraill mewn un ffordd arwyddocaol: mae'n parhau i weithio ym mhresenoldeb cyanid ac asid ar ddosau sy'n atal y camau diweddarach. Y gwahaniaeth hwn yw colyn yr holl stori.

Ymrannu ddaeth gyntaf, ac roedd bron yn esbonio'r mewnlifiad

Ym 1929, gofynnodd Marian Irwin yn Sefydliad Rockefeller gwestiwn symlach. Efallai mai ymrannu rhwng dŵr a haenau brasterog y gell yn unig yw mynediad llifyn, ac y gall haen o glorofform gynrychioli'r haenau brasterog hynny ar fainc y labordy. Yn ei hastudiaethau treiddiad sbectroffotometrig, ysgydwodd hydoddiannau dyfrllyd o lifyn gyda chlorofform a chymharu'r hyn a symudodd i'r wedd organig â'r hyn a aeth i mewn i gelloedd algâu byw.

Mae dau ganfyddiad o'r gwaith hwnnw'n dal i haeddu sylw. Yn gyntaf, roedd hydoddiannau masnachol o las methylen yn cynnwys thionin trimethyl, a elwir bellach yn azure B, ac roedd yr amhuredd yn treiddio'n gyflymach na glas methylen ei hun, yn enwedig ar pH alcalïaidd lle mae'r ffurf bas rhydd sy'n hydawdd mewn lipidau yn dominyddu. Roedd rhywfaint o'r hyn a ymddangosai'n fynediad glas methylen mewn gwirionedd yn fynediad detholus azure B. Yn ail, roedd pH yn pennu'r canlyniad drwy bennu'r cyflwr ïoneiddio, ac roedd celloedd wedi'u hanafu yn gadael llawer mwy o lifyn i mewn na chelloedd cyfan. Cyfernodau ymrannu a chyflwr gwefr oedd yn rheoli'r hyn yr oedd y system artiffisial a'r gell fyw yn ei amsugno, ac roedd y tebygrwydd rhwng y ddwy yn cefnogi'r syniad o haenau annŵr ar ffin y gell.

Roedd y model yn rhagweledol ynghylch lipidau ac ïoneiddio, ond ni allai wahaniaethu rhwng llifyn sy'n ymrannu ar ei ffurf wreiddiol a llifyn sy'n cael ei drawsnewid yn gemegol ar yr arwyneb, yn croesi mewn ffurf gudd, ac yn cael ei drawsnewid yn ôl y tu mewn. Roedd angen arbrawf gwahanol i wneud y gwahaniaeth hwnnw, a daeth hwnnw saith deg mlynedd yn ddiweddarach yn endotheliwm yr ysgyfaint.

Rhydwytho y tu allan, dal y tu mewn

Gweithiodd Merker a'i gydweithwyr gyda chelloedd endothelaidd o rydwelïau ysgyfeiniol gwartheg a dyfwyd mewn meithriniad, a chynigiodd y grŵp ddilyniant tri cham: mae'r llifyn ocsidiedig yn cael ei rydwytho ar arwyneb y gell i'w ffurf lipoffilig ddi-liw, mae'r ffurf rydwythiedig yn tryledu i mewn, ac mae ailocsidio mewngellol yn adfywio'r ffurf ocsidiedig sy'n anathraidd drwy'r bilen ac sy'n cronni. Yna profodd eu hastudiaeth o fewnlifiad thiasin mewn celloedd endothelaidd y dilyniant drwy geisio ei dorri mewn mannau penodol.

Yr offeryn cyntaf oedd ffericyanid, derbynnydd electronau na all fynd i mewn i'r gell. Pan fydd ensymau arwyneb yn rhydwytho llifyn glas i'w ffurf ddi-liw y tu allan i'r gell, gall ffericyanid ddwyn yr electronau hynny yn ôl, gan adfywio llifyn glas yn y cyfrwng cyn iddo groesi. Tra oedd gormodedd o ffericyanid yn bresennol (llifyn 10 micromolar yn erbyn ffericyanid 50 i 500 micromolar), roedd mewnlifiad y llifyn bron yn stopio, a dim ond ar ôl i'r ffericyanid gael ei ddefnyddio i gyd yr ailddechreuodd y mewnlifiad ar ei gyfradd arferol. Roedd y cineteg yn adrodd yr un stori mewn ail ffordd. Diflannodd ffericyanid ar gyfradd a oedd yn weddol gyson, yn gyson â fflwcs rhydwytho arwyneb sefydlog yn bwydo cyfryngwr y gellid ei ailgylchu, tra oedd llifyn allgellol yn diflannu'n esbonyddol wrth i'w gronfa gael ei disbyddu. Mae fflwcs cyson ynghyd â chronfa sy'n cael ei disbyddu yn golygu bod y signal ffericyanid yn dangos rhydwytho parhaus, nid moleciwlau llifyn yn gadael yr hydoddiant.

Roedd yr ail offeryn yn dileu'r cam croesi yn gyfan gwbl. Cysylltodd y grŵp las tolwidin O, perthynas agos ymhlith y thiasinau, â chadwyn polyacrylamid fawr a oedd yn rhy fawr i fynd i mewn i'r gell yn y naill gyflwr ocsidio na'r llall. Roedd celloedd yn dal i rydwytho'r llifyn a oedd wedi'i glymu. Felly nid oes angen mynediad mewngellol ar gyfer rhydwytho. Mae'r peirianwaith yn agored ar yr arwyneb neu wedi'i gyplu'n drydanol ag ef.

Yna daeth y gwahaniaeth sy'n rhoi ei deitl i'r papur. Roedd cyanid ac asid ar 2 millimolar yn atal cronni'r llifyn yn gryf, ac o dan y microsgop roedd y cynhwysion glas tywyll a phorffor sydd fel arfer yn amgylchynu'r cnewyllyn bron wedi diflannu. Eto i gyd, ni wnaeth yr un o'r ddau atalydd arafu rhydwytho allgellol: parhaodd cylchrediad ffericyanid heb leihad ac roedd y polymer nad oedd yn treiddio yn dal i gael ei rydwytho. Roedd y rhwystr ymhellach ymlaen yn y broses. Roedd cyanid ac asid yn atal ailocsidio a dal mewngellol, nid rhydwytho arwyneb. Roedd profion rheoli hyfywedd yn cefnogi'r dehongliad hwn, gan fod y celloedd yn cadw eu hensym marcio cytosolaidd, lactad dehydrogenas, drwy'r triniaethau hyn. Felly nid gwenwyno neu rwygo'r bilen yn unig oedd yn gyfrifol am y gostyngiad mewn mewnlifiad.

Mae un rhybudd o'r papur yn dal yn berthnasol. Roedd y cynhwysion glas o amgylch y cnewyllyn ond nid ynddo, sy'n gyson ag ocsidio y tu mewn i organynnau isgellol, ond ni nododd yr astudiaeth pa organynnau oeddynt. Roedd patrymau tebyg mewn mathau eraill o gelloedd wedi'u galw'n lysosomaidd ar sail tystiolaeth wan. Ystyriwch fod y dal wedi'i sefydlu a bod y lleoliad yn un dros dro. Gall darllenwyr sy'n olrhain ble mae electronau'n mynd nesaf fynd ymlaen i gludiant electronau mitocondriaidd a rheoli rhydocs a'r darlun ehangach o amsugno a dosbarthu yn ôl llwybr.

Nid amlygiad yw staenio

Mae trydedd astudiaeth yn dangos beth sy'n digwydd pan fydd y rhesymeg hon am fewnlifiad yn cwrdd â mesuriad biolegol. Canfu Scott a'i gydweithwyr fod methyl beta cyclodextrin, torws siwgr siâp cylch, yn rhwymo glas methylen yn uniongyrchol, gyda chysonyn cysylltu o tua 310 fesul molar ar gyfer y cymhlyg cynhwysiant o gymharu â thua 5846 fesul molar ar gyfer deumereiddio'r llifyn. Mewn ffibroblastau L929 roedd y rhwymo hwn yn atal staenio'r celloedd ac ysgogi mewnlifiad glwcos: roedd rhag-ddeor gyda'r cyclodextrin yn atal staenio glas, ac roedd ei ychwanegu wedyn yn cyflymu dadstaenio. Wrth i'r signal glas optegol adael y celloedd, pylodd y cludiant glwcos a oedd wedi'i ysgogi mewn cydweddiad agos.

Dehonglodd yr awduron y gydberthynas hon fel rhywbeth a oedd yn ffafrio rhyngweithiad uniongyrchol rhwng y llifyn a phrotein yn y llwybr sy'n actifadu cludydd glwcos yn hytrach na mecanwaith straen ocsidiol hirhoedlog. Mae'r casgliad hwnnw'n rhesymol ond yn gyfyngedig. Nid yw'r arbrawf yn enwi'r protein, nid yw'n dangos rhwymo i'r cludydd ei hun, ac ni all y gydberthynas rhwng dadstaenio a cholli'r effaith ddiystyru pob llwybr a gyfryngir gan rydocs.

Mae'r wers barhaol yn ymwneud â mesur. Mae staenio optegol yn dangos llifyn gweladwy, ocsidiedig, sy'n gysylltiedig â chelloedd. Mae'n methu'r gronfa rydwythiedig ddi-liw yn gyfan gwbl, felly gall cell welw ddal i gynnwys cywerthoedd llifyn, ac mae cell sydd wedi'i staenio'n ddwys yn dangos llifyn ocsidiedig sydd wedi'i ddal yn hytrach na chyfanswm amlygiad y feinwe neu faint yr effaith. Mae'r un rhybudd yn berthnasol ar raddfa fwy: mae cymharu staenio ar draws mathau o gelloedd, neu drin toriad meinwe tywyll fel prawf o amlygiad uwch, yn ailadrodd gwall gwreiddiol y ddysgl. Mae mewnlifiad yn gylchred o rydwytho, trylediad ac ailocsidio, ac mae unrhyw giplun unigol o'r ffurf las yn gweld dim ond un rhan ohono. Mae'r canlyniadau ymarferol ar gyfer staenio a thrin yn y labordy ac ar gyfer dehongli honiadau am ddos ac amlygiad yn dilyn yn uniongyrchol.