Článek
Metoda methylenové modři pro stanovení sulfidů
Metoda methylenové modři stanovuje sulfidy jejich přeměnou na modré barvivo a měřením výsledné absorbance. Methylenová modř je reakční produkt, který nese analytický signál. Přidání obsahu lahvičky methylenové modři do vody není tímto testem.
Obtížné bývá především zachovat reprezentativnost vzorku až do okamžiku reakce. Přesné měření absorbance nemůže nahradit sulfidy, které během odběru unikly nebo zoxidovaly. Nedokáže ani odlišit volný sirovodík od jiných forem síry uvolněných při přípravě vzorku.
Co vytváří modré zbarvení?
V metodě EPA 376.2 reagují sulfidy s dimethyl-p-fenylendiaminem v přítomnosti chloridu železitého za vzniku methylenové modři. Kyselá činidla vytvářejí podmínky pro vznik barviva. Přístroj poté měří absorpci světla výsledným roztokem.
Zjednodušené reakční schéma je:
Sulfidy + N,N-dimethyl-p-fenylendiamin + Fe(III), v kyselém prostředí → methylenová modř → měření absorbance.
Jde o analytické schéma, nikoli o vyčíslenou reakční rovnici. Složení a koncentrace činidel, doba vybarvení, vlnová délka a optická dráha se musí řídit zvolenou metodou.
Tyto parametry nejsou zaměnitelné. EPA 376.2 předepisuje měření při 625 nm. Postup Hach 8131 zdokumentovaný pro přístroj DR/5000 používá 665 nm. Literární údaj o absorbanci methylenové modři nenahrazuje nastavení a kalibraci konkrétního stanovení.
Před odběrem určete sulfidovou frakci
„Koncentrace sirovodíku“ může označovat různé měřené veličiny. Rozpuštěné H₂S a HS⁻ jsou ve vodě propojeny acidobazickými rovnováhami. Jejich poměr závisí na podmínkách včetně pH. Okyselení vzorku toto rozdělení mění; nezachovává původní rozdělení pro pozdější zkoumání.
EPA 376.2 zahrnuje celkové a rozpuštěné sulfidy ve vymezených vzorcích vod a odpadů, ale nezahrnuje sulfidy nerozpustné v kyselinách. Označení „celkové“ ve zprávě využívající tuto metodu proto nelze chápat jako všechny sloučeniny obsahující síru v lahvičce. Sírany jsou jiným analytem a sulfid kovu nerozpustný v kyselinách může zůstat nezachycen.
Před porovnáním výsledků ze dvou laboratoří se zeptejte, jakou frakci každý postup zachytil. Zkontrolujte také způsob vyjádření výsledků: mg/L jako síra a mg/L jako H₂S jsou odlišné způsoby vyjádření hmotnostní koncentrace. Stejné číslo bez shodných jednotek, přípravy a definice analytu neznamená shodu.
Pracovní postup, který chrání měření
Při posuzování navrhovaného laboratorního postupu použijte následující posloupnost. Úvodní ilustrace ukazuje reakci a optické měření; tato tabulka uvádí rozhodnutí, která jim předcházejí.
| Fáze | Co zaznamenat před pokračováním | Čemu záznam předchází |
|---|---|---|
| Vymezení | Vodní, odpadní nebo biologická matrice; rozpuštěná nebo metodou definovaná celková frakce | Porovnávání různých analytů pod stejným označením „H₂S“ |
| Odběr | Čas odběru, teplota, filtrace, nádoba a kontakt se vzduchem | Zacházení se změněným vzorkem jako s původní vodou |
| Stabilizace | Přesný postup konzervace a povolená prodleva | Předpokladu, že samotné chlazení zachová každý vzorek |
| Reakce | Verze metody, šarže činidel, objemy a doba vybarvení | Kombinování neslučitelných částí různých protokolů |
| Měření | Vlnová délka, optická dráha kyvety, slepý vzorek, standardy a ředění | Převodu zbarvení na koncentraci bez správné kalibrace |
| Kontrola | Kontroly výtěžnosti, shoda duplicitních stanovení, mez vykazování a jednotky | Vykazování údaje z přístroje bez jeho analytických omezení |
Shrnutí metody Standard Methods 4500-S²⁻ D v databázi NEMI požaduje minimální provzdušňování a buď okamžitou analýzu, nebo předepsanou konzervaci octanem zinečnatým. Postup konzervace pro celkové sulfidy také využívá zásadité prostředí a zcela naplněnou láhev. Tyto požadavky jsou součástí metodiky práce se vzorkem, nikoli jen běžné laboratorní praxe.
Interference mohou vést k falešně nízkému výsledku
Totéž shrnutí Standard Methods uvádí redukční činidla, která potlačují vznik modrého zbarvení, kovy tvořící nerozpustné sulfidy s nízkou výtěžností a ferrokyanid, který sám vytváří modré zbarvení. Reakci mohou inhibovat také velmi vysoké koncentrace sulfidů.
Slabě zbarvená zkumavka tedy může mít několik vysvětlení: nízký obsah sulfidů, ztráty před analýzou, neúplnou výtěžnost nebo potlačený vznik zbarvení. Silně zbarvená zkumavka může obsahovat rušivé zbarvení. Barva a zákal vyžadují korekci pozadí předepsanou metodou; odečtení libovolného vodního slepého vzorku nemusí být dostatečné.
Užitečnou kontrolou je přidat známé množství sulfidů do reprezentativního vzorku a provést s ním příslušnou přípravu. Pokud se očekávaný přírůstek nezachytí, je třeba prověřit matrici nebo pracovní postup. Ustanovení o řízení kvality v EPA 9030B ukazují, proč se vzorek matrice s přídavkem analytu zpracovává celým postupem společně se slepými vzorky a kontrolními standardy. Přídavek provedený až těsně před měřením nemůže posoudit dřívější ztráty.
Příklad z terénu: horká voda zkomplikuje i pečlivý postup
Studie USGS z Yellowstonu zveřejněná v Open-File Report 2010-1192 porovnávala dva postupy využívající methylenovou modř s metodou iontově selektivní elektrody na konzervovaných geotermálních vzorcích.
Výsledky měření elektrodou byly soustavně vyšší. Výzkumníci u horkých vzorků označili za problémy oxidaci a únik H₂S do plynné fáze. Předmíchání vybarvovacích činidel před přidáním vzorku poskytlo mírně vyšší kolorimetrické výsledky, ale přineslo další problém: smíchané činidlo rychle degradovalo, takže se načasování stalo zdrojem nepřesnosti. Sedm vzorků navíc obsahovalo thiosíran v koncentracích, které autoři spojovali s pravděpodobným podhodnocením kolorimetrických výsledků.
Pro zkoumané geotermální vody autoři upřednostnili okamžitou stabilizaci v zásaditém prostředí s antioxidantem a následné měření elektrodou. Jde o konkrétní závěr k volbě metody pro horkou vodu, nikoli o důkaz, že každé měření elektrodou předčí každé kolorimetrické stanovení.
Zvolte metodu podle analytické otázky
| Analytická otázka | Metoda k posouzení | Hlavní podmínka |
|---|---|---|
| Stanovitelné sulfidy ve vhodné vodní matrici | Zdokumentovaná kolorimetrie s methylenovou modří | Zachovat předepsanou frakci a prokázat výtěžnost v matrici |
| Sulfidy v horké geotermální vodě | Okamžitá stabilizace s validovaným postupem měření elektrodou | Validovat odběr a konzervaci pro danou teplotu a matrici |
| Sulfidy v heterogenních odpadech nebo pevných materiálech | Příprava specifická pro danou frakci, například EPA 9030B, s předepsanou metodou konečného stanovení | Výtěžnost sulfidů nerozpustných v kyselinách může zůstat neúplná; nepředpokládat úplnou extrakci |
| Volné sulfidy oproti formám síry labilním v kyselém prostředí v biologických vzorcích | Selektivní záchyt nebo derivatizace se separací | Určit, která forma síry vytváří měřený signál |
Rozlišení v biologických vzorcích je zásadní. V laboratorní studii Shena a kolegů z roku 2011 zahrnující myší plazmu bylo měření methylenovou modří omezeno zbarvením pozadí, citlivostí a sírou labilní v kyselém prostředí, která se uvolňovala při přípravě. Jejich metoda s monobrombimanem a HPLC separovala derivát sulfidu a za zkoušených podmínek detekovala nižší koncentrace. Šlo o analytickou validaci, nikoli o stanovení klinického diagnostického prahu nebo důkaz účinku léčby.
Kalibrace a podobně pojmenované testy
Kalibrujte pomocí sulfidových standardů definovaných v postupu a použijte stejné reakční a optické podmínky jako u vzorků. Před přepočtem absorbance vzorku zkontrolujte výsledky slepého vzorku a kontrolních standardů. Bezproblémová kalibrační křivka stanovuje vztah pro dané standardy; výtěžnost u vzorku ukazuje, zda tento vztah platí i v matrici.
A konečně, stanovení aniontových tenzidů metodou MBAS využívá methylenovou modř jinak. V EPA 425.1 se již přítomné barvivo váže na povrchově aktivní látky a extrahuje se do organické fáze. Při kolorimetrickém stanovení sulfidů barvivo teprve vzniká. Ani jeden analytický postup není návodem k úpravě vody. Před volbou činidla nebo interpretací modrého zbarvení určete analyt a reakci.