Methylenová modř ve výzkumu dania pruhovaného: chovatelská přísada a faktor zkreslující experimenty

Voda pro jikry dania pruhovaného bývá lehce namodralá a téměř nikdo nezaznamenává proč. Barvivem je methylenová modř, přidávaná proti plísním, a většina protokolů ji považuje za součást pozadí. Pozadí je zde ale nesprávný pojem. Výstižnější je neuvedený experimentální faktor: něco, co je přítomné v miskách s ošetřenými jedinci a chybí v kontrolách, co je při používaných koncentracích farmakologicky aktivní a co dokáže ovlivnit právě ty sledované ukazatele, které experiment měří.

Toto rozlišení je základem všeho, co následuje. Běžné protiplísňové ošetření v chovu je jedna otázka. Zda je přísada neutrální vůči vašemu testu, je otázka jiná. Nedávná literatura o daniu pruhovaném odpovídá na první uklidňujícím způsobem a na druhou znepokojivě.

Co pokyny skutečně předepisují

Neexistuje jediný společný standard, což je součástí problému. Pokyny Canadian Council on Animal Care povolují v roztoku pro přepravu jiker a larev 0.5 mg/L, tedy 0.00005%, ke snížení růstu plísní. Evropské pokyny pro laboratorní zvířata popisují uchovávání embryí v médiu, které často obsahuje stejných 0.00005%. Receptura média E3 z Cold Spring Harbor uvádí jako složku dvojnásobek, 1 mg/L neboli 0.0001%. Proti tomu stojí nápadné opomenutí: metodika OECD pro test toxicity na rybích embryích předepisuje rekonstituovanou ředicí vodu a testovanou chemickou látku, ale doporučení methylenové modři neobsahuje ani ve verzi z roku 2013, ani v pozdější revizi. Jedna laboratoř tedy odchovává embrya dania pruhovaného v modré vodě s methylenovou modří od prvních hodin života, jiná provádí regulační test na embryích v čiré vodě a obě označují své médium za běžné. Každý, kdo porovnává výsledky mezi laboratořemi nebo slučuje historická kontrolní data, tuto nejednotnost přebírá.

Pro představu o koncentracích: 0.00005% odpovídá přibližně 1.56 mikromolu na litr a 0.0001% přibližně 3.13 mikromolu na litr. Jsou to nízká čísla a svádí k závěru, že jsou příliš nízká na to, aby měla význam. Níže uvedené studie ověřují právě tento předpoklad, a to přesně při těchto koncentracích.

Čtenáři, kteří přicházejí spíše z akvaristiky než z laboratoře, se se stejnou molekulou setkávají v jiném prostředí, popsaném v akvaristickém průvodci methylenovou modří. Chemie je stejná; vysvětlení toho, jak barvivo přenáší elektrony v buňkách, objasňuje, proč se redoxně aktivní sloučenina stále objevuje v pracích o metabolismu. Následující text se týká konkrétně vody pro jikry dania pruhovaného s methylenovou modří.

Metabolismus: směr účinku se mění podle stadia

Nejpřínosnější studie vystavila normálně se vyvíjející dania pruhovaná methylenové modři od prvního dne života do 5 dnů po oplození a v každém stadiu měřila oxidativní metabolismus, jak popisuje publikovaná zpráva o experimentech s metabolismem embryí. Průběh je třeba popsat přesně, protože se směr účinku obrací.

1 den po oplození vzrostla u exponovaných embryí bazální spotřeba kyslíku při obou koncentracích používaných v chovu. Ve 2 dnech byl mitochondriální membránový potenciál v povrchové vrstvě larev zvýšen při expozici koncentracím 0.00005%, 0.0001% i 0.0003%. Ve 4 až 5 dnech, po vylíhnutí, se směr obrátil: oxidativní energetický výdej klesl, ať už expozice probíhala nepřetržitě od oplození, nebo pouze akutně od dne 3 do dne 4. Současně kleslo množství transkriptů podjednotek mitochondriálních respiračních komplexů v 1 i 4 dnech spolu s transkripty souvisejícími se steroidogenezí a glukoneogenezí.

Obraz upřesňují dvě další pozorování. Při vyšší koncentraci používané v chovu probíhalo líhnutí mírně dříve: exponovaná embrya měla ve 2 dnech náskok a kontroly je do dne 3 dohnaly. Samotná stresová osa přitom zřejmě zůstala neporušená: když byly 5denní larvy vystaveny stresoru v podobě víření vody, celotělová hladina kortizolu v obou skupinách normálně vzrostla. Barvivo tedy při těchto dávkách není obecně působícím vývojovým jedem a netlumí všechny fyziologické reakce. Ovlivňuje energetický metabolismus v závislosti na stadiu: před vylíhnutím jej zvyšuje a po něm snižuje.

Chování: proč se dvě studie rozcházejí a proč mohou mít obě pravdu

Literatura o chování působí rozporuplně, dokud se neporovnají uspořádání expozice. Jedna studie vývojové a behaviorální bezpečnosti vystavovala embrya přibližně od 6 hodin po oplození koncentracím až 10 mikromolů na litr, roztoky denně obnovovala do dne 4, poté larvy přemístila na dny 5 a 6 do média bez barviva a v den 6 testovala pohybovou aktivitu při střídání světla a tmy. Výsledek: žádný významný vliv na mortalitu, líhnutí či morfologii a žádný vliv ošetření na pohybovou aktivitu. Autoři oprávněně doporučili 10 mikromolů na litr jako horní hranici za svých podmínek.

Druhá skupina, jejíž autoři se částečně překrývali s autory metabolické studie, uspořádala expozici tak, jak skutečně probíhá v chovu: barvivo bylo přítomné od 2 až 3 hodin po oplození, médium se denně částečně obnovovalo a chování se měřilo během expozice nebo krátce po ní. Při stejných běžných koncentracích vykazovaly larvy sníženou pohybovou aktivitu v 24hodinovém testu, což bylo reprodukovatelné napříč kmeny i laboratořemi. Studie zkreslení behaviorálních výsledků přitom spojila účinek se serotonergním tonem, v souladu se známou inhibicí monoaminooxidázy tímto barvivem. Nejvýmluvnější bylo, že embryonální médium obsahující methylenovou modř maskovalo očekávanou pohybovou reakci na fluoxetin ze skupiny SSRI. Screeningový test prováděný v modré vodě proto může přehlédnout účinek léčiva, který by čirá voda odhalila.

Ve skutečnosti nejde o rozpor. Sloučenina může v jednom testu dva dny po vymytí nezanechat žádný zjistitelný zbytkový účinek a v jiném stále působit, dokud je přítomná. Praktický závěr je, že nulový výsledek opravňuje ke stanovení horní hranice koncentrace, nikoli k tvrzení o neutralitě, zatímco pozitivní výsledek popisuje podstatné riziko: aktivní expozici během měření, a to přesně v uspořádání, které používá většina laboratoří.

Redoxní barvivo v redoxním testu

Ještě jedna nástraha si zaslouží vlastní odstavec, protože zkresluje samotný měřicí systém, nikoli zvíře. Test energetického výdeje Alamar Blue je sám založen na redoxní chemii: resazurin se redukuje na fluorescenční resorufin. Methylenová modř je rovněž redoxně aktivní. V bezbuněčných kontrolách obě koncentrace používané v chovu po 24 hodinách mírně, ale významně snížily fluorescenci Alamar Blue. V pokusech se zvířaty byla exponovaná embrya před testem nejméně třikrát promyta médiem bez barviva a biologický účinek u vylíhnutých larev převyšoval bezbuněčnou interferenci. Platí tedy obojí: u promytých zvířat přetrvává skutečný metabolický účinek a nevymyté barvivo navíc přidává přímý chemický artefakt. Kontroly musí tyto dva jevy oddělit, jinak ani jedna hodnota nemá vypovídací význam. Obecné pokyny k interpretaci výsledků testů založených na barvivech zde mají mimořádnou váhu.

Časový přehled vývojových stadií

Původní přehled vytvořený pro tento článek. Pokud není uvedeno jinak, jde o dvě standardní koncentrace používané v chovu, 0.00005% a 0.0001%.

Zapamatovat si je třeba počáteční vzestup a pozdější pokles metabolických ukazatelů, přičemž účinky na chování jsou přítomné během expozice a po odstranění látky nebyly zjistitelné v jediném testu, který tuto situaci ověřoval.

Kontrolní seznam pro návrh kontrol

Druhý původní přehled. Použijte jej, když se chovatelské protokoly pro danio pruhované s methylenovou modří prolínají s experimentem.

1. Uvádějte barvivo jako činidlo, nikoli jako vodu. Uveďte koncentraci v procentech i v mikromolech na litr, začátek a konec expozice v hodinách nebo dnech po oplození, režim obnovy média a interval vymývání před každým měřením.
2. Přizpůsobte kontroly výzkumné otázce. Studie testované chemické látky potřebuje kontroly bez barviva; studie chovatelského postupu potřebuje skupiny bez barviva a s barvivem se zaznamenaným protiplísňovým výsledkem, protože ani jedna z citovaných studií neměřila protiplísňovou účinnost.
3. Před redoxními testy promývejte a poté výsledek ověřte. Promyjte nejméně třikrát médiem bez barviva a souběžně proveďte bezbuněčnou kontrolu s barvivem a činidlem, protože barvivo přímo snižuje signál Alamar Blue.
4. Považujte ukazatele chování a monoaminů za vysoce rizikové. Studie pohybové aktivity, úlekové reakce, chování podobného úzkosti, antidepresiv a inhibitorů MAO by se měly během měření barvivu vyhnout nebo prokázat jeho neutralitu pro konkrétní sledovaný ukazatel; vymývání po dobu jednoho až dvou dnů odstranilo jeden účinek na pohybovou aktivitu, ale u jiných experimentálních uspořádání to prokázáno není.
5. Považujte metabolické a mitochondriální ukazatele za vysoce rizikové v každém stadiu. Spotřeba kyslíku, energetický výdej, membránový potenciál a transkripty dýchacího řetězce se při koncentracích používaných v chovu mění, a to před vylíhnutím a po něm opačnými směry.
6. Nepřenášejte závěry o neutralitě mezi různými uspořádáními. Nulový výsledek po vymytí nevypovídá o probíhající expozici; nulový morfologický výsledek nevypovídá o metabolismu ani interakci s léčivem; výsledek u jednoho kmene, při jedné teplotě nebo jedné délce testu nevypovídá o ostatních.
7. Uveďte pokyny, kterými jste se řídili, i jejich alternativu. Výslovně pojmenujte koncentrace podle CCAC, evropských pokynů nebo Cold Spring Harbor a upozorněte na to, kde test na embryích podle OECD barvivo neuvádí, aby čtenář mohl zasadit podmínky vašich zvířat do souvislostí.

Nic z toho není argumentem proti používání barviva k udržení jiker při životě. Je to argument proti tomu, aby se chovatelské rozhodnutí bez prověření promítalo do dat. Modrá barva v misce pochází z molekuly s farmakologickými účinky a největší riziko zkreslení hrozí právě u vysokokapacitních metabolických a neurobehaviorálních screeningů, pro které jsou dnes raná vývojová stadia dania pruhovaného preferovaným modelem. Zaznamenejte ji, zahrňte ji do kontrol, před měřením ji vymyjte a ověřte test, do něhož může nenápadně zasahovat.