Methylenová modř a zánětlivá signalizace: inflamazomy, IL-6 a STAT3

Představme si, že tři laboratoře oznámí, že stejná modrá sloučenina působí protizánětlivě. Jedna prokáže méně IL-1beta z makrofágů. Druhá prokáže méně enzymu iNOS ve stejném typu buněk. Třetí prokáže méně IL-6 v krvi a nižší aktivitu STAT3 v mozku. Nabízí se spojit všechny tři výsledky do jediného tvrzení. Takové spojení však zastírá podstatu zjištění.

Každý výsledek patří k jinému mechanismu signalizace s vlastním spouštěčem, krokem sestavování a měřeným ukazatelem. Methylenová modř do každého mechanismu zasahuje v jiném bodě. Zda některý z těchto dějů zlepšuje zdravotní výsledky, je samostatná otázka, které se věnuje náš přehled methylenové modři a zánětu. Tato stránka se zaměřuje na signální dráhy.

Dráha 1: sestavování inflamazomu a kaspáza-1

Inflamazom je proteinová struktura, která se podle potřeby vytváří uvnitř myeloidní buňky. Jeho součástmi jsou senzor, adaptor zvaný ASC a efektorový enzym zvaný kaspáza-1. Po sestavení kaspáza-1 štěpí pro-IL-1beta a pro-IL-18 na jejich sekretované formy a může spustit pyroptózu, zánětlivou formu buněčné smrti. Typ inflamazomu určuje senzor: NLRP3 reaguje na krystaly a toxiny tvořící póry, například nigericin, a na ATP, NLRC4 reaguje na bakteriální flagelin, AIM2 reaguje na cytosolovou dvouřetězcovou DNA a nekanonická dráha reaguje na intracelulární lipopolysacharid.

Aktivace vyžaduje dva signály. Prvním signálem je příprava: ligand receptoru podobného Toll spouští transkripci NLRP3 a pro-IL-1beta závislou na NF-kB, čímž vznikají potřebné součásti. Druhým signálem je sestavování: další podnět způsobí oligomerizaci ASC do shluků, štěpení kaspázy-1 na její fragment p20 a uvolnění zralého IL-1beta p17. Mitochondriální reaktivní formy kyslíku a příjem krystalů jsou známými faktory přispívajícími k druhému signálu u NLRP3.

Studie široké inhibice inflamazomů v makrofázích z roku 2017 testovala methylenovou modř u obou signálů. U myších makrofágů z kostní dřeně připravených lipopolysacharidem vyvolávaly nigericin, ATP i krystaly urátu sodného uvolňování IL-1beta a kaspázy-1 spolu s tvorbou shluků ASC. Methylenová modř v koncentraci 20 až 200 mikromolárních snižovala všechny tři ukazatele v závislosti na dávce, aniž by buňky usmrcovala. Stejný vzorec se objevil při použití flagelinu a salmonel pro NLRC4, dvouřetězcové DNA a listerií pro AIM2 a transfekovaného lipopolysacharidu nebo živých E. coli pro nekanonickou dráhu. Samotná sloučenina uvolňování nespouštěla a kontrolní kultivační destičky neprokázaly antibakteriální účinek, takže výsledek souvisí s odpovědí hostitele.

V předcházejících krocích dráhy byly měřeny tři zásahy. Methylenová modř snižovala tvorbu mitochondriálního superoxidu vyvolanou rotenonem a současně klesalo i uvolňování IL-1beta vyvolané rotenonem. Klesal příjem fluorescenčních částic, což odpovídá omezené fagocytóze před rozpoznáním krystalů. Reportér řízený promotorem NLRP3 se dvěma vazebnými místy pro NF-kB vykazoval při použití methylenové modři nižší aktivitu, zatímco zkrácený promotor bez těchto míst nereagoval. V bezbuněčném systému ve zkumavce methylenová modř také přímo snižovala aktivitu rekombinantní lidské kaspázy-1. Přidání sloučeniny pouze během přípravy nebo pouze během aktivace stále snižovalo uvolňování IL-1beta, IL-18 a kaspázy-1, takže se účinek týká obou kroků.

Testy na myších tuto selektivitu potvrdily. Smrtelná dávka lipopolysacharidu usmrtila kontrolní zvířata během několika hodin, zatímco methylenová modř zlepšila přežití; peritoneální IL-1beta klesl, ale IL-6 ve stejné tekutině nikoli. V modelu peritonitidy vyvolané listeriemi klesl peritoneální IL-1beta, zatímco celkový počet buněk se nezměnil. Lidské monocyty THP-1 se u všech čtyř typů inflamazomů chovaly podobně jako myší makrofágy. Výsledek týkající se inflamazomu vysvětluje zrání IL-1beta a IL-18, nikoli každý cytokin. Proto také tvar imunitních buněk v mozku v experimentech s mikrogliemi a astrocyty odpovídá na jinou otázku než sestavování proteinové struktury.

Dráha 2: transkripce iNOS prostřednictvím vazby NF-kB a STAT1

Inducibilní syntáza oxidu dusnatého neboli iNOS je v klidovém stavu přítomna jen minimálně a její transkripce se spouští podle potřeby. Lipopolysacharid ji indukuje především prostřednictvím degradace IkB-alpha, po níž následuje fosforylace NF-kB a jeho vstup do jádra. Interferon-gamma ji indukuje především prostřednictvím fosforylace STAT1 Janusovou kinázou, po níž následuje vstup STAT1 do jádra. Každý z těchto faktorů se pak váže na své místo v promotoru iNOS. Aktivita enzymu a indukce genu představují samostatné regulační body a léčivo může působit na jeden z nich nebo na oba.

Studie indukce iNOS v makrofázích a u myší s endotoxémií z roku 2015 lokalizovala účinek na úroveň mRNA. V buňkách RAW 264.7 a primárních myších makrofázích snižovala methylenová modř v koncentraci 1 mikromolární, podaná 30 minut před lipopolysacharidem, interferonem-gamma nebo oběma, množství proteinu iNOS a jeho mRNA v průběhu 8 až 24 hodin. Současně bylo v médiu méně dusitanů a nedošlo ke snížení životaschopnosti buněk. U myší, kterým byl podán lipopolysacharid v dávce 25 mg na kg, snížila jediná dávka methylenové modři 5 mg na kg podaná o jednu hodinu dříve množství proteinu iNOS a jeho mRNA v plicích, játrech a srdci.

Pozoruhodné je to, co se nezměnilo. Degradace IkB-alpha, fosforylace NF-kB, fosforylace STAT1 i hromadění obou faktorů v jádře zůstaly zachovány. Narušení nastalo o krok později: jaderné extrakty vykazovaly po působení lipopolysacharidu menší vazbu NF-kB na jeho úsek DNA a po působení interferonu-gamma menší vazbu STAT1. Chromatinová imunoprecipitace potvrdila nižší obsazení promotoru iNOS oběma faktory uvnitř buněk. Klesl také tumor nekrotizující faktor alfa, jehož promotor rovněž využívá NF-kB. Faktory se aktivovaly a dorazily do jádra, ale na svou cílovou DNA se vázaly hůře.

Všimněte si rozdílu oproti dráze 1. Zde jde o vazbu faktorů na DNA, uplatňuje se STAT1 namísto STAT3 a měřenými ukazateli jsou mRNA, protein a dusitany, nikoli shluky ASC a fragmenty kaspázy-1. Naše mapa cílů methylenové modři napříč buněčnými modely odděluje tuto transkripční úroveň od přímých měření enzymů a mitochondrií.

Dráha 3: sérový IL-6 a aktivace STAT3 v tkáních

IL-6 přenáší signál prostřednictvím rodiny receptorů gp130 do kaskády od Janusovy kinázy ke STAT3. Fosforylovaný STAT3 dimerizuje, vstupuje do jádra a spouští zánětlivé programy, zatímco samotný IL-6 je cílem NF-kB. Tyto složky tak tvoří zpětnovazebnou smyčku často označovanou jako osa IL-6–STAT3. Standardními měřenými ukazateli jsou sérový IL-6 na začátku dráhy, poměr fosforylovaného STAT3 k celkovému STAT3 a efektorové enzymy, například iNOS a COX2, v následných krocích.

Studie IL-6 a STAT3 po podání lipopolysacharidu u myší z roku 2023 měřila tuto osu v různých kompartmentech. Samci myší C57BL/6 dostávali lipopolysacharid v dávce 1 mg na kg denně po dobu tří dnů a 30 minut po každé dávce methylenovou modř v dávce 5 nebo 10 mg na kg. Třetí den byl sérový IL-6 v obou skupinách s methylenovou modří nižší než při podávání samotného lipopolysacharidu, zatímco většina ostatních cytokinů v měřeném panelu se při podávání methylenové modři nezměnila. Poměry fosforylovaného STAT3 k celkovému STAT3 byly nižší v mozkové kůře, hipokampu a kůži ucha. Zároveň bylo slabší barvení mikroglií na Iba-1, nižší hladiny iNOS a COX2 a částečně zmírněný úbytek hmotnosti.

Zde je třeba uvést dvě výhrady. Nižší sérový IL-6 spolu s nižší fosforylací STAT3 v tkáních odpovídá modulaci této osy, ale neurčuje hlavní místo zásahu. Stejný poměr by totiž mohl být výsledkem menšího množství cytokinu na začátku dráhy, slabší receptorové signalizace nebo změněné aktivity fosfatáz. A hmotnost během tří dnů akutního působení podnětu je ukazatelem na úrovni celého zvířete, nikoli skóre příznaků nebo remise. Doplňuje kontext nad rámec výsledku blotu, aniž by ze zjištění o signalizaci vytvářela tvrzení o léčbě. Samostatné chemické děje související s mitochondriálními redoxními procesy probíhají souběžně s těmito cytokinovými mechanismy a neměly by se s nimi slučovat.

Porovnání drah: místa zásahu a měřené ukazatele

Tabulka brání třem neoprávněným přenosům závěrů. Výsledek týkající se shluků ASC neprokazuje výsledek týkající se STAT3. Výsledek týkající se vazby STAT1 na promotor iNOS neprokazuje výsledek týkající se STAT3, přestože oba proteiny patří do rodiny STAT. Výsledek týkající se sérového IL-6 neprokazuje omezené sestavování inflamazomu: v peritoneálním experimentu IL-1beta klesl, zatímco IL-6 nikoli. Každý řádek potřebuje vlastní spouštěč a měřený ukazatel. Proto je při čtení buněčných, zvířecích a klinických studií methylenové modři nutné přiřadit každé tvrzení k úrovni, na níž bylo měřeno.

Nic z toho nestanovuje dávkování, bezpečnost ani přínos u lidí. Modely s lipopolysacharidem představují kontrolované podněty pro testování mechanismu, nikoli napodobeniny chronického onemocnění. Podávání látky současně s podnětem navíc testuje prevenci vyvolané změny, nikoli zvrácení již rozvinutého onemocnění. Tento popis mechanismů oddělujte od výsledků u pacientů a každé zdravotní tvrzení posuzujte podle studie na pacientech, která jej podkládá.