Methylenová modř a ALS: proč se výsledky v různých experimentálních modelech liší

Když vyhledáte methylenovou modř a ALS, narazíte na dvě tvrzení, která si zdánlivě odporují. Jedno říká, že modré barvivo chránilo neurony v modelech ALS. Druhé říká, že u myši s ALS nemělo žádný účinek. Obě tvrzení odkazují na skutečné vědecké články a oba články si zaslouží vážnou pozornost. Rozpor zmizí, jakmile pojmenujete princip, na němž každý experiment stojí: rozsah tvrzení určuje model.

Výsledek u hlístice je tvrzením o hlístici. Výsledek u rybí larvy je tvrzením o rybí larvě. Ani jeden není tvrzením o pacientovi, dokud jej nepodpoří výsledky sledování průběhu onemocnění u savce. Tento článek porovnává dvě nejčastěji citované studie vedle sebe, abyste viděli, proč se jejich odpovědi liší.

Dva experimenty v jedné tabulce

Při čtení mějte tuto tabulku po ruce. Obsahuje všechny důležité rozdíly mezi studiemi.

Liší se genetický podklad, druh, způsob podávání, načasování i sledované parametry. Genotyp je jen jedním z pěti rozdílů, takže tato dvojice studií nemůže prokázat, že methylenová modř působí selektivně na jednu dráhu spojenou s ALS. Prokazuje něco užšího, ale přesto užitečného: výrazná obnova funkcí při časné přímé expozici v jednoduchých modelech se nepromítla do průběhu onemocnění u savce při dlouhodobém perorálním podávání.

Pozitivní výsledek: co ukázala studie na hlísticích a rybách

Ve studii na hlísticích a rybách z roku 2012 vědci nechali v motorických neuronech hlístic exprimovat mutantní lidský TDP-43 nebo FUS a do rybích embryí injikovali mutantní lidskou mRNA. Jde o modely proteotoxicity. Během několika dní napodobují toxické účinky mutantního proteinu na pohyb a tvar neuronů, nikoli celý mnohaletý průběh ALS u dospělého člověka.

Podávání začalo velmi brzy. Hlístice od vylíhnutí rostly na agaru obsahujícím methylenovou modř. Rybí embrya byla od 24 hodin po oplození přes noc v roztoku látky a jejich chování se testovalo přibližně o dva dny později. Mezi látkou a neuronem nestála hematoencefalická bariéra tak, jak je tomu u savce, a koncentrace látky v plazmě ani v mozku nebyla měřena.

Za těchto podmínek byly účinky výrazné a konzistentní. Koncentrace 6 i 60 μM snížily paralýzu závislou na věku u hlístic s TDP-43 a FUS. Ve 12. dni dospělosti bylo paralyzováno přibližně 80 procent neléčených hlístic s TDP-43 oproti asi 10 procentům hlístic, kterým byla látka podávána od vylíhnutí. Stejným směrem ukazoval i synaptický test: hlístice s TDP-43 byly přecitlivělé na aldikarb, látku používanou k testování nervosvalového přenosu, a methylenová modř posunula odpověď zpět k normálu. Počty degenerujících výběžků motorických neuronů klesly, přičemž nejzřetelnější účinek byl při 60 μM. U ryb se výrazně zlepšilo plavání vyvolané dotykem a zkrácené motorické axony při 30 nebo 60 μM dorůstaly směrem k normální délce, i když obnova byla pouze částečná, nikoli úplná.

Údaje o oxidačním stresu odpovídaly antioxidačnímu vysvětlení. U mutantních hlístic a ryb byly zvýšené ukazatele reaktivních forem kyslíku, které při podávání látky klesaly, a normální hlístice vystavené methylenové modři přežívaly prooxidační zátěž mnohem déle než hlístice bez ní. Důležitá jsou ale dvě omezení. Celkové hladiny mutantních proteinů TDP-43 a FUS neklesly a studie přímo nekvantifikovala proteinové agregáty, takže ukazuje obnovu funkcí, aniž by prokazovala odstranění agregátů. Každý, kdo sleduje, jak se obvykle formulují hypotézy týkající se redoxních procesů a mitochondrií, by měl tento mechanismus považovat za podpořený, nikoli za definitivně prokázaný.

Nejpoučnějším detailem bylo načasování. Když autoři zahájili podávání až v 5. dni dospělosti, podíl paralyzovaných hlístic ve 12. dni činil asi 55 procent místo přibližně 10 procent při podávání od vylíhnutí. Stejná látka, stejná hlístice, stejná mutace, ale mnohem menší účinek. Časná preventivní expozice se podílela na velké části pozorovaného přínosu.

Nulový výsledek: co ukázala studie na myších se SOD1

Studie na myších z roku 2011 položila náročnější otázku v přísněji vymezeném systému. U kongenních myší se SOD1 G93A postupuje onemocnění od třesu zadních končetin přes poruchu chůze a ztrátu vzpřimovacího reflexu až k předem definovanému terminálnímu cílovému bodu. Podávání začalo před nástupem příznaků ve 45. dni a pokračovalo denně, přičemž pozorovatelé hodnotili neurologický stav na škále od 0 do 6. Jde o experiment sledující celý průběh onemocnění, a proto je bližší tomu, co by zajímalo pacienta, než jakákoli křivka paralýzy u hlístice.

Hlavní výsledky byly nulové. Celkový nástup příznaků nastal u kontrol ve 121 dnech oproti 124 dnům při podávání methylenové modři; tento rozdíl nebyl významný. Přežití do terminálního stadia činilo 167 dní oproti 170 dnům, rovněž bez významného rozdílu. Několik dílčích sekundárních výsledků vyznělo ve prospěch podávání: u samic se nástup příznaků opozdil přibližně o 7 dní a zvířata, kterým byla látka podávána, strávila o něco více času v mírnějších stadiích a méně v těžkých. Vzhledem k malým podskupinám podle pohlaví a mnoha srovnáním mezi stadii slouží tyto dílčí výsledky spíše k tvorbě hypotéz než jako důkaz. Nebyly měřeny počty neuronů, agregace SOD1 ani oxidační či zánětlivé markery, takže studie také nemůže říci, zda látka dosáhla svých cílů a selhala, nebo je při této dávce vůbec neovlivnila. Testována byla pouze jedna dávka.

Sami autoři upozornili na nejzásadnější omezení, které platí v obou směrech. Model SOD1 G93A s vysokým počtem kopií dobře napodobuje onemocnění způsobené toxicitou SOD1, ale tato forma představuje jen malou část familiární ALS a její biologický podklad se liší od většiny sporadických případů. Navrhli znovu testovat kandidátní látky v savčích modelech založených na TDP-43. Tento návrh se od té doby zkomplikoval, protože autoři studie na hlísticích a rybách uvádějí, že ani samostatná studie methylenové modři na myším modelu TDP-43 nezlepšila motorické výsledky. Látka tedy může vykazovat výrazný účinek v jednom systému TDP-43 a žádný v jiném systému TDP-43. Na systému záleží stejně jako na genu.

Proč zlepšení u hlístice nebo ryby nemůže prokázat přínos pro pacienty

O každém modelu uvažujte jako o odpovědi na jinou otázku.

Zaprvé se liší biologie. TDP-43 a FUS jsou proteiny vázající nukleové kyseliny, které v těchto jednoduchých systémech sdílejí genetické interakce, zatímco toxicita SOD1 působí prostřednictvím částečně odlišných bezprostředních mechanismů. Látka, která zmírňuje jeden typ proteotoxického stresu, nemusí zmírňovat druhý. Úspěch proti nadměrné expresi v embryu navíc nemusí předpovídat úspěch proti pomalé neurodegeneraci v dospělosti, provázené zánětem, zapojením gliových buněk a celkovým zhoršováním stavu organismu.

Zadruhé se liší expozice. Nepřetržitá expozice v roztoku při mikromolárních koncentracích není totéž co perorální podávání. Mezi spolknutou dávkou a míšním motorickým neuronem stojí vstřebávání ve střevě, metabolismus při prvním průchodu, vazba na plazmatické bílkoviny, průnik do mozku a clearance. Ani jedna studie neměřila koncentrace látky v nervovém systému, takže nelze propojit koncentrace použité v obou studiích.

Zatřetí se liší načasování. Přínosy u hlístic a ryb silně závisely na podávání před nahromaděním patologických změn. U myší podávání také začalo před příznaky, což je silná stránka studie, avšak u lidí by léčba téměř vždy začínala až po nástupu příznaků, tedy ještě později. Signál preventivního účinku ve dvoudenním testu na embryích je výchozím bodem pro výzkum, nikoli modelem klinického použití.

Začtvrté se liší sledované parametry. Paralýza ve 12 dnech, citlivost na aldikarb, délka axonů v mikrometrech a uplavaná vzdálenost jsou bezprostřední fenotypové projevy. Nástup příznaků a přežití u savce zahrnují vliv všech kompenzačních i komplikujících procesů v těle. Látky běžně mění dílčí ukazatele, aniž by ovlivnily přežití, a právě proto se u savců používají sledované parametry založené na době do určité události.

Čtenáři, kteří chtějí kontrolní seznam pro posouzení dalšího titulku, jej mohou převzít z článku jak číst preklinické studie: ptejte se na druh organismu, transgen, dávku a způsob podání, zda byly měřeny koncentrace látky, kdy podávání začalo vzhledem k rozvoji patologických změn, zda sledovaným parametrem byl krátkodobý fenotyp, nebo průběh onemocnění, a zda se účinek podařilo zopakovat v druhé laboratoři. Širší soubor důkazů o methylenové modři u lidí zůstává místem, kde je třeba ověřovat, zda se některý z těchto časných signálů rozvinul v klinická data.

Co to znamená pro pacienty a rodiny

Z těchto studií nevyplývá žádný zavedený protokol použití methylenové modři u ALS. Pozitivní studie podporuje další výzkum oxidačních a synaptických mechanismů v biologii TDP-43 a FUS. Nulová studie mluví proti očekávání, že dlouhodobé perorální podávání při této expozici změní průběh onemocnění typu SOD1. Společně popisují nejednotné výsledky napříč modely, nikoli doporučení k léčbě.

Bezpečnost si zaslouží stejně střízlivý pohled jako účinnost. Studie ALS na myších neříkají nic o bezpečném dávkování u lidí a methylenová modř nese skutečná rizika: hemolýzu při deficitu G6PD a serotoninovou toxicitu při kombinaci se serotonergními léky. Podezření na deficit G6PD, současné užívání antidepresiv a jakákoli plánovaná změna medikace patří do rozhovoru s lékařem, stejně jako posouzení obecných údajů o bezpečnosti methylenové modři předtím, než někdo začne jednat podle titulků o laboratorních výsledcích.

Závěr se vejde do jedné věty. Methylenová modř při časné expozici výrazně obnovila fenotypové projevy u hlístic a rybích larev s TDP-43 a FUS, ale ve studii s dlouhodobým perorálním podáváním u myší se SOD1 nepřinesla v podstatě žádný přínos z hlediska nástupu příznaků ani přežití, takže poctivým výkladem jsou důkazy závislé na modelu, které nepodporují použití u pacientů.