Kdo vyvinul fialové barvení krevních nátěrů? Methylenová modř, Malachowski, Romanowsky a Giemsa

Eosin je červený. Methylenová modř je modrá. Smíchejte je, naneste směs na zaschlý krevní nátěr a některé jeho části se zbarví fialově.

Ne všechny. V dobře připraveném preparátu se jádra bílých krvinek zbarví červenofialově a uvnitř malarického parazita získá stejnou barvu chromatin, zatímco okolní červené krvinky zůstanou růžové a cytoplazma šedomodrá. Právě fialová umožňuje rozlišit jednotlivé typy buněk.

Ani jedna lahvička neobsahuje fialovou barvu. Ta vzniká teprve tehdy, když se na sklíčku setká určitý produkt rozkladu methylenové modři s eosinem. V 80. a 90. letech 19. století však nikdo nevěděl, že takový produkt existuje, natož co je zač. Lidé, kteří se snažili tuto barvu získat, pracovali samostatně s nečistými barvivy a neměli spolehlivý způsob, jak zjistit, co je v lahvičce poté, co dva měsíce stála na polici.

Proto má otázka v názvu více než jednu obhajitelnou odpověď a proto se odpověď v roce 2011 změnila.

Co bylo vidět, se měnilo se směsí

Toto barvení nevzniklo jediným vynálezem. Vyvíjelo se postupně. Každá změna směsi přinesla právě jednu novou viditelnou informaci a sled těchto informací je nejpřehlednějším způsobem, jak jeho historii pochopit.

Důležitá je posloupnost v posledním sloupci. Každý pokrok rozšířil škálu barev a každé rozšíření zviditelnilo další strukturu. Fialová není ozdobným prvkem této techniky; představuje rozdíl mezi tím, zda vidíme přítomnost parazita, a tím, zda vidíme, z čeho se skládá. Cesta samotného barviva z barvírny BASF do medicíny má delší historii s vlastními dokumenty. Celá výše uvedená posloupnost se zdrojem ke každé položce je dostupná jako časová osa přispěvatelů s odkazy na zdroje.

Obrázek: stejných šest směsí znázorněných podle toho, co bylo v misce a co z ní vzešlo. Kruhy obsahují barviva; obdélníky pod nimi ukazují barvy, které tato barviva dokázala vytvořit v krevním nátěru. Před rokem 1890 se červenofialový obdélník neobjevuje a po něm už nikde nechybí.

Muž, který použil borax záměrně

Ernst Malachowski byl lékař v tehdejším Breslau, dnešní Vratislavi. Svou kariéru strávil v soukromé praxi a na malé klinice, kterou vedl s kolegou, a laboratorní práci se věnoval ve volném čase. Narodil se ve Strzelně 12. března 1857, studoval medicínu na Vratislavské univerzitě a v letech 1882 až 1887 pracoval jako asistent na interním oddělení nemocnice Všech svatých, tehdy druhé největší nemocnice v Německu.

V roce 1888 začal s dvojitým barvením podle Chęcińského a Plehna. V preparátu připraveném v roce 1889 si všiml, že se chromatin jádra plasmodia barví jinak než cytoplazma, ale výsledek pak nedokázal zopakovat. Zkusil methylenovou modř okyselit, což situaci zhoršilo. Zkusil ji alkalizovat boraxem, což fungovalo pokaždé. Metodu veřejně předvedl 15. června 1890 a v srpnu 1891 zveřejnil podrobnější popis včetně pokynu k použití boraxu. Uvedl, že barvení trvá dvacet čtyři hodin a výsledky jsou snadno reprodukovatelné.

Dvacet čtyři hodin je v diagnostické laboratoři dlouhá doba a jeho článek se fialovočervenou barvou jádra parazita podrobně nezabýval. Ať už byl důvod jakýkoli, záměrné alkalizace methylenové modři se nikdo neujal, dokud ji v roce 1898 znovu nepoužil Nocht. Malachowski už o barvení krve nikdy nepsal.

Důvod, proč se o něm až donedávna vědělo tak málo, spočívá v archivech, nikoli v nějaké záhadě. V lékařské literatuře se nedochovaly téměř žádné stopy jeho života a to, co přežilo, se zachovalo jedinou cestou. Jeho dcera Marie odešla v roce 1939 z Německa do Londýna, sloužila v britské armádě a usadila se v Kanadě. Její sbírka rodinných písemností nakonec skončila v Institutu Lea Baecka v New Yorku. Její bratr Leo padl v první světové válce. Její sestra Eva byla v dubnu 1942 deportována z Vratislavi do tranzitního tábora Izbica a nikdy se nevrátila. Její matka Hedwig si 22. dubna 1942 vzala život, aby nemusela čekat na stejnou deportaci. Malachowski zemřel v roce 1934, ještě před všemi těmito událostmi.

Rodinná historie, která takto končí, je historií, na niž se přestává odkazovat. Dva články, které Malachowského znovu zařadily do dějin vývoje tohoto barvení, oba vydané v roce 2011, byly sestaveny z archivních dokumentů v Poznani a Vratislavi a z Mariiných písemností v New Yorku.

Plesnivá lahvička a Rus, který měl štěstí

Dmitri Romanowsky studoval medicínu na Vojenské lékařské akademii v Petrohradě a většinu své kariéry se zabýval malárií. V roce 1890 zveřejnil metodu, která byla na papíře téměř totožná s Chęcińského metodou: nezměněná methylenová modř a eosin, jen s o něco větším množstvím eosinu.

V září 1891 zveřejnil metodu, která ho proslavila, a podstatný detail byl ukrytý v pokynech. Nejlepších výsledků dosahoval se zásobním roztokem methylenové modři, který stál přes dva měsíce a rostla na něm plíseň. Plíseň a doba stání způsobily částečnou demethylaci barviva. Romanowsky to nevěděl a nedokázal to řídit. Ostatním pracovníkům, kteří jeho metodu zkoušeli, se fialovou získat nedařilo. Svou disertaci odevzdal v Petrohradě v červnu 1891, a proto se v běžném výkladu považuje za rok objevu rok 1891.

Malachowski metodu předvedl už v červnu 1890, o více než rok dříve, a jeho metoda fungovala záměrně.

Proč barvení dostalo jméno nesprávného člověka

Argumenty ve prospěch Malachowského shromáždili Kristine Krafts, Ernst Hempelmann a Barbara Oleksyn a opírají se o čtyři skutečnosti. Datum veřejného předvedení: červen 1890 oproti září 1891. Slovo záměrný oproti slovu náhodný. Skutečnost, že Malachowski zveřejnil svou metodu včetně boraxu, zatímco Romanowského metoda závisela na nekontrolované proměnné. A zjištění, že popis jádra plasmodia spolu s fialovou barvou, která jej zviditelnila, na sedm let prakticky zmizel z literatury, protože nikdo nedokázal náhodnou verzi zopakovat.

Svůj závěr formulují bez obalu. V životopisném článku označují přisouzení zásluh za „výsměch“ a citují Ralpha Lillieho, který v roce 1978 napsal, že „bychom možná měli tuto skupinu barvení označovat jako Malachowského barvení“.

Tento nárok je sporný, jak už nároky na prvenství bývají, a povahu sporu stojí za to spíše vysvětlit než rozhodnout. Spor o prvenství musí určit, v čem objev spočíval. Pokud je objevem fialová barva, Malachowski má dřívější doložené předvedení. Pokud je objevem zveřejněná metoda, oba muži publikovali v roce 1891 a barvení získalo Romanowského jméno. Pokud je objevem vysvětlení, nemá na prvenství nárok ani jeden, protože ani jeden nevěděl, že zrání znamená demethylaci, a ani jeden nedokázal říci, proč se barva vůbec objevuje. Právě tento poslední bod populární výklady opomíjejí. Účinnou složkou byla nečistota, kterou nikdo neidentifikoval, a první člověk, který barvu získal záměrně, vycházel z reprodukovatelného empirického receptu, nikoli z pochopení toho, co tento recept způsobuje.

Oba články z roku 2011 představují nejúplnější zveřejněné zdůvodnění Malachowského prvenství a oba jsou volně dostupné přes PubMed: rozsáhlý přehled pod PMID 21235291 a životopisný článek pod PMID 21660627. Záznam přehledu v PubMed také uvádí komentář k němu, zveřejněný ve stejném časopise později téhož roku na 86(5):366. Je to přiměřená připomínka, že argumentace byla v odborném tisku zpochybněna hned po svém zveřejnění.

Tento spor však není neshodou o chemii. Všichni zúčastnění se shodují na tom, co fialová barva je a které složky ji vytvářejí. Neshoda se týká toho, kdo k ní dospěl jako první a zda se náhoda, kterou nikdo nedokázal zopakovat, vůbec počítá jako dosažení cíle.

Co přinesla pozdější jména

Pokud fialovou jako první získal Malachowski, proč barvení nese jména Romanowského, Wrighta a Giemsy?

Protože barvení, které jednou funguje v rukou svého vynálezce, ještě není laboratorním činidlem. Pozdější práce proměnily nevyzpytatelnou směs v něco, co mohl v úterý použít laborant v jiné zemi.

Nocht k výsledku dospěl úvahou. Poté, co se mu s jednoduchým neutrálním barvivem nepodařilo získat spolehlivý výsledek, usoudil, že fialová musí pocházet z něčeho v methylenové modři, co samo methylenovou modří není, a začal to hledat. Unna si už dříve všiml, že staré roztoky methylenové modři barví granula žírných buněk červeně, a navrhl, že při zrání barviva vzniká nová látka. Bernthsen v roce 1885 ukázal, že alkalické podmínky odštěpují z methylenové modři methylové skupiny a že vzniklé produkty jsou tím, co dnes nazýváme azury. Nocht extrahoval aktivní frakci chloroformem a dokázal ji označit pouze jako červeň z methylenové modři; Michaelis ji v roce 1901 pojmenoval azur I. Jenner vyřešil praktickou stránku přípravy. Opětovné rozpuštění sraženiny methylenové modři a eosinu v absolutním methanolu poskytlo jediný stabilní roztok, který nátěr při barvení zároveň fixoval a odstranil potřebu fixace teplem. Leishman a Reuter spojili polychromované barvivo s alkoholovým rozpouštědlem a získali současně stabilitu i fialovou barvu. Wright nahradil dvanáctihodinovou inkubaci při 65 °C a desetidenní stání hodinou v proudící páře. Giemsa přestal na náhodně vyzrálý roztok spoléhat úplně a používal odměřená množství známých barviv s glycerolem v methanolu, aby přípravek odolal tropickému horku. Nikdy nezveřejnil, jak připravoval čistý methylenový azur. Prodával jej laboratoři doktora Grüblera v Lipsku, která ho uváděla na trh jako azur I a tvrdila, že pouze její verze je pravým Giemsovým barvivem.

O identitě tohoto azuru se stále vedou spory. Někteří se domnívají, že šlo prostě o polychromovanou methylenovou modř, jiní, že byl bohatý na Azure B. Odpověď přinesla válka. Když se německá barviva stala nedostupnými, tým americké služby veřejného zdraví, Ralph Lillie spolu s Mauricem Roem a Aimee Wilcox, zjistil, že nejlepší barvení poskytují tři oddělené složky: nezměněná methylenová modř, její demethylovaný produkt rozkladu Azure B a eosin. Azure B nahradil nedostupný azur I a tyto tři složky dodnes tvoří základ barvení používaného k diagnostice malárie.

Chemie vzájemného působení těchto tří složek na sklíčku je samostatnou otázkou a tématem jiné stránky. Článek úlohy barviv a chemie barvení Romanowského typu vysvětluje, co dělají Azure B a eosin a proč jejich kombinace vytváří barvu, kterou ani jeden z nich sám nevytváří. Stránka mikroskopie a laboratorní využití se věnuje praktické stránce: co daný preparát ukazuje a jak posoudit, zda je konkrétní přípravek vhodný pro metodu, kterou chcete použít.

Část historie, která je stále aktuální

Jeden detail tohoto příběhu nepřestal platit v roce 1902. Zhruba padesát let byla nejdůležitější složkou celosvětově standardního barvení pro malárii nepojmenovaná nečistota. Byla v něm náhodou, její množství se mezi lahvičkami lišilo, po část této doby byla její identita obchodním tajemstvím a o jejím podílu se vedly spory až do 40. let 20. století. Lidé, kteří barvení používali, nebyli nedbalí. Neměli jak zjistit, co je v lahvičce.

Moderní podobou stejného problému je specifikace, která popisuje jen část materiálu. Shoda s USP je cestou k nejvyšší čistotě, kterou trh nabízí, protože jde o úplný zveřejněný standard, nikoli o jediné měření: identita, čistota, organické nečistoty včetně azurových barviv, zbytková rozpouštědla, elementární nečistoty, zbytek po žíhání, mikrobiální limity a bakteriální endotoxiny. Blupreme získává svou methylenovou modř od farmaceutického výrobce a zveřejňuje úplný certifikát analýzy, takže každý bod tohoto seznamu lze ověřit, místo aby zůstal pouhým tvrzením. Certifikát, který uvádí výsledek stanovení těžkých kovů a označuje jej za shodu s USP, je dnešní obdobou lahvičky s označením „vyzrálá methylenová modř“: možná kvalitní činidlo, ale etiketa vám neříká, co v něm je.