Hodnocení vzhledu kolonií E. coli a dalších mikroorganismů na EMB agaru

Student naočkuje neznámý vzorek roztěrem na eosin-methylenový modrý agar, inkubuje jej přes noc a druhý den najde na plotně tmavé kolonie se zeleným leskem. Do zápisníku napíše „E. coli, potvrzeno“. Tento zápis tvrdí víc, než lze z plotny doložit. Plotna ukazuje fenotyp růstu a fermentace za konkrétních podmínek. Určení druhu je samostatný závěr, který vyžaduje samostatné důkazy.

Tento průvodce pojímá výsledky na EMB agaru jako úlohu vyžadující interpretaci. Vysvětluje základní princip, provází ilustrativním atlasem ploten včetně kontrol a uvádí případy, kdy učebnicový obraz vede k omylu.

Princip fungování plotny

EMB agar je selektivní i diferenciační. Barviva eosin Y a methylenová modř potlačují růst mnoha grampozitivních mikroorganismů, takže médium zvýhodňuje růst gramnegativních mikroorganismů. Tatáž barviva fungují jako indikátory: když mikroorganismus fermentuje dostupný cukr a místně vytvoří dostatek kyseliny, kolonie intenzivně přijímá barvivo a zbarví se tmavě fialově až modročerně. Při intenzivní tvorbě kyseliny může povrch kolonie vykazovat kovově zelenou iridescenci. Protokol ASM pro plotny s eosin-methylenovým modrým agarem popisuje tuto kombinaci selekce a diferenciace a poskytuje referenční fotografie pro výuku.

Před hodnocením jakéhokoli výsledku je důležitý jeden detail: ověřte, jaké složení média se používá. Starší varianta Holt Harris Teague obsahuje laktózu i sacharózu, zatímco Levine EMB obsahuje pouze laktózu. Mikroorganismus, který fermentuje sacharózu, ale ne laktózu, například mnohé izoláty Serratia marcescens, může na těchto dvou variantách vypadat odlišně. Dokumentace výrobce k médiím EMB tento rozdíl ve složení výslovně uvádí. Do zápisníku zaznamenejte vedle výsledku také výrobce a složení média.

Připravený nenaočkovaný EMB agar bývá červenohnědý až červenofialový, někdy se zelenavým nádechem nebo jemnou sraženinou. Toto zbarvení podkladu není růst. Každý nález porovnávejte s nenaočkovanou plotnou nebo zdokumentovaným výchozím stavem a primární plotnu hodnoťte přibližně po 18 až 24 hodinách aerobní inkubace při 35 až 37 C, pokud výukový protokol nestanoví jinak. Delší inkubace může změnit vzhled související s fermentací.

Jak plotnu pozorovat

Použijte dva způsoby osvětlení. Nejprve plotnu prohlédněte v odraženém nebo šikmém světle a naklánějte ji: kovový lesk je iridescentní a podle úhlu pohledu se může objevit nebo zmizet. Poté ji prohlédněte v procházejícím světle, abyste posoudili barvu kolonií a jejich tmavé středy. Vycházejte z dobře izolovaných kolonií, protože hustý růst a sousední kolonie mění místní hromadění kyseliny a mohou zbarvení potlačit nebo zvýraznit. Soubor snímků ASM to přímo ukazuje: E. coli ve smíšené kultuře může ztratit očekávaný lesk, protože okolní mikroorganismy mění kyselost prostředí.

Zařazujte kontroly vždy, když to cvičení umožňuje. Běžná výuková sestava zahrnuje E. coli ATCC 25922 pro fenotyp s modročerným zbarvením a kovovým leskem, nefermentující mikroorganismus, například Salmonella Typhimurium ATCC 14028 nebo Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, pro bezbarvý fenotyp a grampozitivní mikroorganismus, například Enterococcus faecalis nebo Staphylococcus aureus, jako kontrolu inhibice, jak uvádějí standardní tabulky kontroly kvality pro média EMB. Pokud pozitivní kontrola nemá lesk, hledejte nejprve příčinu v inkubaci, hustotě růstu nebo složení média, teprve potom v neznámém vzorku.

Ilustrativní atlas ploten

Níže uvedené plotny jsou vygenerované ilustrace, nikoli fotografie skutečných kultur. Ukazují vzor, který máte hledat, nikoli přesný odstín konkrétního kmene. Porovnávejte je s referenčními fotografiemi ASM a se skutečnými plotnami z výukové laboratoře.

Plotna 1: Escherichia coli na EMB agaru, intenzivně fermentující laktózu

E. coli na EMB agaru bývá tmavě fialová až modročerná, často s tmavým středem a kovově zeleným leskem vznikajícím při intenzivní tvorbě kyseliny. Lesk je známý nález, který studenti hledají, ale berte jej jako podpůrný důkaz, nikoli jako určující znak. Intenzita lesku se mění podle kmene, doby inkubace, hustoty kolonií a úhlu pohledu. Nepřítomnost lesku nevylučuje E. coli a tmavá kolonie bez lesku může ukazovat na několik dalších fermentujících mikroorganismů. Pro jakoukoli navazující práci vyberte dobře izolovanou kolonii místo hodnocení hustě porostlého sektoru.

Plotna 2: Klebsiella pneumoniae na EMB agaru, hlenovitý fermentující mikroorganismus

Klebsiella pneumoniae na EMB agaru obvykle tvoří velké, lesklé, hlenovité kolonie v růžovofialových až hnědofialových odstínech, často s tmavými středy, ale obvykle bez výrazného kovového lesku. Podobná morfologie se vyskytuje u příbuzných fermentujících mikroorganismů, například Enterobacter. Hlenovitá konzistence a velikost kolonie jsou součástí hodnocení: malá a plochá růžová kolonie má jinou výpovědní hodnotu než velká, vyklenutá a hlenovitá. Stejně jako u E. coli plotna naznačuje fenotyp fermentace a určení na úrovni druhu vyžaduje biochemické potvrzení popsané níže.

Plotna 3: Salmonella na EMB agaru a další nefermentující mikroorganismy, bezbarvé kolonie

Salmonella na EMB agaru a příbuzné mikroorganismy nefermentující laktózu, včetně Shigella a mnoha izolátů Pseudomonas, obvykle rostou jako bezbarvé až průsvitné nebo světle jantarové kolonie. Některá složení média a podmínky vedou k slabému narůžovělému nádechu, takže světle růžová kolonie automaticky neznamená fermentující mikroorganismus. EMB nerozlišuje Salmonella od Shigella ani od jiných nefermentujících mikroorganismů; toto rozlišení je úkolem následných testů. Pamatujte také, že byly zdokumentovány laktóza-pozitivní kmeny Salmonella s kovově lesklými koloniemi podobnými E. coli, což je další důvod, proč jediná plotna nemůže identifikaci uzavřít.

Plotna 4: Serratia marcescens a úskalí složení média

Serratia marcescens si zaslouží vlastní oddíl, protože studenti často očekávají červené kolonie a pak plotnu nesprávně vyhodnotí. Většina klinických izolátů nefermentuje laktózu, takže na Levine EMB bývají bledé až slabě zbarvené. Protože mnoho izolátů fermentuje sacharózu, médium obsahující sacharózu může vyvolat tmavší zbarvení nebo výraznější reakci spojenou s tvorbou kyseliny. Při 35 až 37 C neočekávejte ani typický červený pigment prodigiosin; při teplotě inkubátoru je jeho tvorba nespolehlivá. Když protokol uvádí Serratia marcescens na EMB agaru, ověřte, jaké složení média dané tvrzení předpokládá. Přehled metabolismu Serratia shrnuje laktóza-negativní fenotyp a proměnlivou fermentaci sacharózy, které stojí za tímto úskalím.

Plotna 5: kontroly a inhibované mikroorganismy

Grampozitivní mikroorganismy, například Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus a Bacillus, jsou na EMB agaru obecně inhibovány nebo výrazně potlačovány, i když inhibice není u každého kmene úplná. Sada kontrol umožňuje poctivé hodnocení: kontrola E. coli by měla vykazovat dobrý růst s modročerným zbarvením a leskem, kontrola nefermentujícího mikroorganismu by měla vykazovat bezbarvý růst a kontrola inhibice by měla vykazovat malý nebo žádný růst. Pokud kontrola inhibice dobře roste, selektivní účinek selhal a všechna ostatní hodnocení na této šarži jsou zpochybněna. Barvicí metody odpovídají na jinou otázku než kultivační média; barvení preparátů v laboratoři se věnuje atlas barvení methylenovou modří.

Srovnání s vymezením závěrů

Zavádějící vzhled lze shrnout třemi větami. Tmavá barva neznamená E. coli, protože Klebsiella, Enterobacter a další fermentující mikroorganismy vytvářejí tmavé středy bez lesku. Růžová barva neznamená Klebsiella, protože středně intenzivně nebo pomalu fermentující mikroorganismy a některé mikroorganismy běžně označované jako nefermentující mohou být růžové nebo světle fialové. Lesk neznamená definitivně E. coli, protože jej mohou vytvářet i jiné intenzivně fermentující mikroorganismy. Výukový protokol a jeho obrázky smíšených kultur ilustrují každý z těchto chybných závěrů.

Meze potvrzení

EMB agar vypovídá o fenotypu, nikoli o druhu. Různé mikroorganismy mohou mít stejný vzhled kolonií a jeden mikroorganismus se může od svého učebnicového obrazu odchylovat podle kmene, stáří, hustoty růstu, složení média a inkubace. Proto se ve výukových i klinických postupech morfologie na EMB používá pouze k předběžnému určení.

Obhajitelný postup pro studenta je následující: popsat izolovanou kolonii (velikost, barvu, střed, lesk v šikmém světle, hlenovitý charakter), zaznamenat složení média, dobu a teplotu inkubace a kontroly; poté před jakýmkoli potvrzujícím testem přeočkovat dobře izolovanou kolonii a získat čistou kulturu. Běžné navazující vyšetření zahrnuje Gramovo barvení a reakce IMViC pro předběžnou identifikaci E. coli a koliformních bakterií, TSI nebo KIA a biochemické panely specifické pro daný mikroorganismus u střevních mikroorganismů, případně sérologickou identifikaci, MALDI TOF nebo jiné validované metody identifikace, pokud to úloha vyžaduje. Souvislosti začlenění EMB mezi selektivní a diferenciační média pro střevní mikroorganismy najdete v úvodech ke kultivačním médiím pro střevní mikroorganismy a v článku o navazujícím Gramově barvení. Související otázku, co modře obarvený preparát může a nemůže prokázat, řeší atlas barvení methylenovou modří, který ve stejném duchu odděluje pozorování od závěru.

Pozorování zapište před závěrem. „Tmavé modročerné kolonie se zeleným leskem závislým na úhlu pohledu na Levine EMB po 24 hodinách, odpovídající intenzivní fermentaci laktózy“ je obhajitelné. „E. coli, potvrzeno“ vyžaduje potvrzující krok, který samotná plotna nemůže poskytnout.