Article
Un consum d'oxigen més alt implica més ATP? Lliçons dels estudis sobre el blau de metilè
Un mitocondri aïllat es troba en una cambra amb combustible però sense ADP. Consumeix oxigen lentament. Si hi afegim ADP, el consum d'oxigen es multiplica diverses vegades. Si esperem que l'ADP s'esgoti, el consum d'oxigen torna a baixar. El combustible no ha canviat en cap moment. Només ha canviat la demanda d'ATP.
Aquesta petita seqüència conté tota la distinció de què tracta aquest article. El consum d'oxigen mesura la velocitat amb què els electrons flueixen per la cadena respiratòria fins a l'oxigen. La producció d'ATP mesura quina part d'aquest flux es captura com a energia utilitzable. Tots dos processos comparteixen un pas intermedi, el gradient de protons a través de la membrana mitocondrial interna, i qualsevol factor que modifiqui el grau d'acoblament entre el gradient i la síntesi d'ATP pot fer que els dos resultats evolucionin en direccions diferents. El blau de metilè és un bon exemple per entendre-ho perquè s'ha observat que fa totes dues coses: augmenta el consum d'oxigen alhora que l'ATP en algunes preparacions, i augmenta el consum d'oxigen mentre l'ATP es manté estable o disminueix en d'altres.
Els lectors que vulguin primer una visió més àmplia d'aquest transport poden començar per com el blau de metilè transporta electrons a través de la cadena respiratòria, i els que vulguin conèixer el vocabulari dels primers experiments amb oxigen poden llegir què van mostrar realment les primeres mesures de respiració.
La respiració, l'ATP i el gradient que els connecta
Els electrons del NADH i del FADH2 entren a la cadena pels complexos I i II, passen pel complex III fins al citocrom c i, després, pel complex IV fins a l'oxigen. L'energia alliberada als complexos I, III i IV bombeja protons des de la matriu cap a l'espai intermembranós. Aquesta separació de càrrega i acidesa constitueix la força protomotriu, i la seva part elèctrica, el potencial de membrana, acostuma a ser la predominant.
L'ATP-sintasa permet que els protons tornin a la matriu i utilitza l'energia alliberada per unir ADP i fosfat i formar ATP. Per tant, la seqüència és:
consum d'oxigen, després bombeig de protons, després gradient i, finalment, síntesi d'ATP.
El problema és que els protons poden tornar per altres vies. Qualsevol retorn que no passi per l'ATP-sintasa és una fuga de protons. La fuga obliga la cadena a tornar a bombejar els mateixos protons per mantenir estable el potencial de membrana, cosa que consumeix més oxigen sense produir més ATP. Una fuga prou intensa provoca desacoblament: el consum d'oxigen augmenta mentre l'ATP es manté estable o disminueix, i l'energia desaprofitada es dissipa en forma de calor.
Estat 3, estat 4 i quocient de control respiratori
El vocabulari clàssic per descriure aquests processos prové dels mitocondris aïllats. L'estat 3 és la respiració en presència de substrat i ADP: l'ATP-sintasa dissipa el gradient, el potencial de membrana baixa, la cadena s'accelera per restablir-lo i el consum d'oxigen és alt perquè s'està produint ATP. L'estat 4 és la respiració després que l'ADP s'hagi esgotat: l'ATP-sintasa queda inactiva, el gradient augmenta, el potencial de membrana elevat dificulta que continuï el bombeig i el consum d'oxigen baixa fins al nivell necessari per compensar la fuga.
El quocient de control respiratori, l'estat 3 dividit per l'estat 4, indica, per tant, el grau d'acoblament de la preparació. Un quocient alt significa que l'ADP controla fortament la respiració. Un quocient que disminueix mentre l'estat 4 augmenta significa que la fuga està guanyant protagonisme. Aquesta és la perspectiva que permet entendre els resultats amb blau de metilè que es presenten a continuació.
Convé tenir present un model mental. Un potencial de membrana alt alenteix la cadena. Dissipar el potencial l'accelera. La cadena respon a la dificultat del bombeig, no directament a si s'està produint ATP.
Quan els resultats evolucionen alhora
L'exemple més clar d'acoblament prové de mitocondris aïllats de cervell de cobai amb complexos respiratoris bloquejats. Amb blau de metilè entre 100 nanomolar i 1 micromolar, el consum d'oxigen en repòs va augmentar amb glutamat més malat, succinat o glicerofosfat com a combustible, mentre que la respiració estimulada per ADP no va canviar. En mitocondris amb el complex I o el complex III inhibit per un tòxic, el colorant va augmentar modestament la producció d'ATP, va restablir el potencial de membrana i va millorar la captació de calci. La via proposada és una drecera: el colorant accepta electrons abans del punt de bloqueig i els transfereix al citocrom c, evitant el complex danyat.
Un segon cas d'acoblament utilitza una font d'ATP completament diferent. En mitocondris aïllats de cervell amb l'ATP-sintasa inhibida, el blau de metilè continuava estimulant la respiració amb tots els substrats provats. Però la síntesi d'ATP només va augmentar amb alfa-cetoglutarat i glutamat, els dos substrats que formen succinil-CoA. Amb l'ATP-sintasa bloquejada per oligomicina, l'ATP addicional provenia de la fosforilació a nivell de substrat per la succinil-CoA-ligasa en el cicle de l'àcid cítric, no de la fosforilació oxidativa. El colorant també va restablir el potencial de membrana quan el complex I i l'ATP-sintasa es van inhibir alhora. Aquí el consum d'oxigen i l'ATP van augmentar conjuntament, però només quan el substrat permetia la segona via de producció d'ATP. Amb succinat o malat, la respiració va augmentar sense ATP addicional. El mateix colorant, la mateixa cambra, un combustible diferent i una resposta diferent.
Quan els resultats divergeixen
Els casos de divergència també estan publicats i són igualment instructius. En un estudi de 1997 amb mitocondris aïllats de fetge de rata, el blau de metilè va accelerar la respiració en estat 4 de mitocondris ben acoblats que respiraven amb succinat, cosa que va fer disminuir el quocient de control respiratori. L'efecte era visible a partir de 0.5 micromolar i intens a 5 micromolar, una concentració propera als nivells plasmàtics després d'un bol intravenós de 100 mil·ligrams. A 5 micromolar, els mitocondris també es van inflar, tot i que el defecte d'acoblament va aparèixer primer a concentracions més baixes, cosa que indica que la fuga va precedir el dany estructural, en lloc de ser-ne una conseqüència. En mitocondris desacoblats, el colorant va estimular la respiració de manera saturable i dependent de la concentració. El consum d'oxigen va augmentar en totes dues preparacions. La síntesi d'ATP per unitat d'oxigen consumit, no. És un exemple de manual de desacoblament i transport d'electrons en una mateixa molècula.
La divergència més marcada prové de la retina. En ratolins amb dèficit d'AIF i cèl·lules fotoreceptores tractades amb rotenona, el blau de metilè va preservar el gruix de la retina, els marcadors dels fotoreceptors i l'estructura mitocondrial, i va reduir la relació NADH/NAD i va atenuar les vies d'estrès, incloses la resposta a les proteïnes desplegades i la mitofàgia. Ho va fer sense corregir el dèficit d'ATP. La protecció sense restabliment de l'energia significa que el benefici es va produir a través de l'equilibri redox i la integritat mitocondrial, no a través d'ATP addicional. Qui equiparés la supervivència del teixit amb el restabliment de la producció d'energia interpretaria aquest experiment de manera completament errònia.
El treball amb mitocondris cerebrals afegeix una columna de costos al mateix balanç. Les mateixes concentracions baixes que milloraven la bioenergètica també augmentaven la generació de peròxid d'hidrogen en totes les condicions provades i n'alentien l'eliminació, mesurada amb un assaig Amplex calibrat en lloc d'un colorant inespecífic. Més ATP i més oxidant anaven de bracet.
Una llista pràctica per interpretar els resultats
Quatre preguntes permeten distingir un resultat acoblat d'un de desacoblat.
Primer, quin paràmetre es va mesurar realment. El consum d'oxigen per si sol no pot informar sobre l'ATP. La síntesi d'ATP, el potencial de membrana i el quocient de control respiratori aporten, cadascun, una informació que l'elèctrode d'oxigen no pot detectar. La guia per interpretar les afirmacions de la recerca sobre el blau de metilè explica amb detall aquest rigor en la interpretació dels paràmetres mesurats.
Segon, quin substrat alimentava els mitocondris. El resultat amb succinil-CoA mostra que l'elecció del combustible pot determinar si la respiració addicional es pot convertir en ATP addicional.
Tercer, quina concentració es va utilitzar. El blau de metilè en concentracions nanomolars fins a micromolars baixes en mitocondris cerebrals va produir millores bioenergètiques modestes amb un cost oxidant; a partir de mig micromolar en mitocondris hepàtics, va deteriorar l'acoblament; a 5 micromolar, s'hi va afegir inflament. La concentració forma part del mecanisme, no és un detall secundari.
Quart, en quin model es va obtenir el resultat. Els mitocondris aïllats revelen les connexions internes, però les cèl·lules i els teixits intactes hi afegeixen el transport, la reducció a la forma incolora i altres vies que competeixen pels electrons. Els estudis de dosificació al laboratori, inclosa la manera com la concentració i el protocol modulen els efectes del blau de metilè, són el pont entre les xifres de la cambra i qualsevol afirmació sobre una persona.
El consum d'oxigen informa sobre el flux d'electrons. L'ATP informa sobre quina part d'aquest flux s'ha capturat. El blau de metilè pot modificar qualsevol dels dos, i els experiments anteriors mostren les quatre combinacions següents: tots dos augmenten, la respiració només augmenta quan el substrat ho permet, la respiració augmenta mentre l'acoblament disminueix, i el teixit es preserva mentre l'ATP es manté estable. La xifra de l'elèctrode d'oxigen és el començament de la interpretació, no el final.