Article
Blau de metilè i Bartonella: resultats de laboratori i límits de l'evidència clínica
Una placa de cultiu i un pacient comparteixen una paraula, infecció, però no un concepte. A la placa, la infecció és un recompte de colònies sobre agar. En el pacient, són bacteris dins de cèl·lules i vasos, fàrmacs que circulen per la sang i els teixits, i un sistema immunitari que fa part de la feina. Si es confonen les dues coses, una xifra de laboratori sorprenent comença a semblar un tractament. Si es mantenen separades, la mateixa xifra esdevé allò que és: un motiu per fer l'experiment següent.
Mantenir aquesta separació és l'objectiu d'aquesta revisió sobre el blau de metilè i Bartonella. Dos estudis de laboratori d'un mateix grup de recerca van provar el blau de metilè contra Bartonella henselae en estats sense creixement. Tots dos van descriure una activitat elevada en recipients de vidre i plàstic. Cap dels dos no el va provar en persones.
Per què els investigadors estudien la fase estacionària
La majoria de les proves d'antibiòtics utilitzen cèl·lules en creixement. Aquest model deixa fora un cas més difícil: cèl·lules que han deixat de dividir-se i toleren fàrmacs que maten les seves homòlogues en creixement.
Bartonella pot persistir al cos, fins i tot dins dels eritròcits i les cèl·lules endotelials. Per això, el grup es va preguntar quins fàrmacs aprovats poden matar B. henselae un cop ha entrat en fase estacionària. Una concentració mínima inhibitòria (MIC) baixa contra cèl·lules en creixement no predeia l'eliminació de les cèl·lules en fase estacionària. La rifampicina tenia una MIC molt baixa, però matava poc les cèl·lules estacionàries, mentre que compostos amb valors de MIC més alts les mataven eficaçment. Els lectors que vulguin un mètode general per abordar aquest tipus d'article el trobaran a la guia per llegir recerca sobre el blau de metilè.
Primer cribratge: Li i col·laboradors, 2019
El cribratge de fase estacionària de 2019 a Antibiotics va utilitzar una sola soca, B. henselae JK53, cultivada en medi de Schneider amb un 10 per cent de sèrum fetal boví a 37 C amb un 5 per cent de CO2. Els cultius d'un dia contenien sobretot cèl·lules disperses en divisió. Els cultius de cinc dies, amb aproximadament 10 elevat a 8 unitats formadores de colònies per mL, es van considerar en fase estacionària i contenien agregats visibles.
L'assaig utilitzava SYBR Green I amb iodur de propidi, calibrat amb mescles de cèl·lules vives i cèl·lules mortes amb isopropanol. Com que el blau de metilè té una coloració intensa, els resultats positius es van confirmar per microscòpia i després mitjançant recomptes de colònies en agar sang, el criteri de valoració més estricte.
D'entre 1,581 fàrmacs aprovats a 50 micromolar, el blau de metilè va deixar una viabilitat del 16 per cent segons el lector de plaques i del 25 per cent segons la microscòpia. La daptomicina va donar un 21 per cent, diversos azoles entre el 22 i el 27 per cent, la gentamicina un 32 per cent, l'eritromicina un 66 per cent i la ciprofloxacina un 74 per cent. El pamoat de pirvini semblava més potent segons el lector, però no es va poder avaluar per microscòpia a causa de la seva pròpia fluorescència.
Contra B. henselae en creixement, la MIC del blau de metilè era de 0.08 a 0.16 micrograms per mL. Contra cèl·lules estacionàries de cinc dies, a 5 micrograms per mL, el recompte va baixar fins a no detectar cap colònia després d'un dia d'exposició, igual que amb la daptomicina i el pamoat de pirvini a les concentracions provades. Una prova separada de cinètica de mort va utilitzar 10 micrograms per mL. Són nivells d'exposició de laboratori, no dosis, i l'article els presenta com a tals. Un valor citat de concentració plasmàtica màxima en humans proper a 3.9 micrograms per mL apareix a l'article només com a context. La visió general de la farmacocinètica del blau de metilè explica per què una xifra plasmàtica no es pot interpretar com una xifra tissular.
L'article explicita dos límits. No hi havia cap model de biopel·lícula ni proves de combinacions amb blau de metilè. Els agregats de cinc dies eren agrupacions en un cultiu líquid estacionari, no un experiment validat de biopel·lícula. Els autors van demanar estudis en animals, de combinacions, de biopel·lícules i proves amb altres espècies de Bartonella.
Combinacions i cèl·lules derivades de biopel·lícules: Zheng i col·laboradors, 2020
L'estudi de seguiment de 2020 a BMC Microbiology va mantenir la mateixa soca i el mateix medi, però va passar a cultius estacionaris de sis dies i va afegir dues coses que faltaven al primer article: combinacions de dos fàrmacs i un model de cèl·lules derivades de biopel·lícules.
Amb fàrmacs individuals a una concentració uniforme de 5 micrograms per mL durant 24 hores, el blau de metilè va deixar 3.2 vegades 10 elevat a 4 unitats formadores de colònies per mL, davant d'un control proper a 2.8 vegades 10 elevat a 10. La ciprofloxacina, la gentamicina i la nitrofurantoïna van deixar menys colònies en el mateix moment. Això difereix del resultat de 2019, en què el mateix nivell nominal no va deixar cap colònia detectable després d'un dia. L'edat del cultiu, la densitat i la manipulació eren diferents; per tant, l'efecte bactericida era reproduïble pel que fa al sentit del resultat, però no idèntic en magnitud. Aquesta variació entre proves és una de les raons per les quals les comprovacions habituals de seguretat i interaccions tracten la potència de laboratori com una qüestió separada de l'efecte clínic.
El cribratge de combinacions és la part més citada. Cada component es va fixar a 5 micrograms per mL. Tant l'azitromicina amb blau de metilè com la rifampicina amb blau de metilè van donar una absència de colònies detectables en fase estacionària a les 24 hores, igual que les dues combinacions amb ciprofloxacina, i només aquestes quatre d'entre les 25 combinacions provades. No es va fer cap anàlisi formal de sinergia; per tant, el terme correcte és combinació activa en aquestes condicions, no sinergia demostrada.
L'experiment de biopel·lícula va provar cèl·lules recuperades d'una biopel·lícula jove disgregada, no la penetració en una biopel·lícula madura intacta. Els cultius es van fer créixer durant cinc dies, es van diluir en plaques de pous durant cinc dies més, es van confirmar mitjançant tinció amb cristall violeta i després es van raspar abans de l'exposició als fàrmacs. A 5 micrograms per mL, el blau de metilè sol va reduir el recompte fins a 2.3 vegades 10 elevat a 2 el dia 6, un dels millors resultats entre els agents individuals, però no fins a zero. Les dues combinacions amb blau de metilè van arribar a zero el dia 6, igual que les dues combinacions amb ciprofloxacina.
Els autors van assenyalar els mateixos límits que detectaria un lector atent: una biopel·lícula jove raspada en lloc d'una biopel·lícula antiga intacta, una concentració pràctica comuna per a tots els fàrmacs en lloc del pic realista propi de cadascun, només combinacions seleccionades centrades en l'azitromicina o la rifampicina, una sola soca, cap animal i cap pacient. Es van proposar estudis posteriors amb tres fàrmacs, però no se'n van presentar resultats.
Comparació del disseny dels estudis
| Aspecte del disseny | Li 2019 | Zheng 2020 | Què es considera evidència clínica |
|---|---|---|---|
| Organisme | Només B. henselae JK53 | Només B. henselae JK53 | Pacients amb bartonel·losi confirmada, criteris de valoració definits |
| MIC del blau de metilè en cèl·lules en creixement | De 0.08 a 0.16 micrograms per mL | La mateixa, de 0.08 a 0.16 | No aplicable |
| Model estacionari | Cultiu de 5 dies, fàrmacs individuals | Cultiu de 6 dies, fàrmacs individuals més 25 combinacions de dos fàrmacs | Activitat tissular i intracel·lular, farmacocinètica |
| Model de biopel·lícula | Cap, els agregats no són una biopel·lícula | Cèl·lules derivades d'una biopel·lícula de 5 dies raspada | Biopel·lícula intacta o dades de persistència in vivo |
| Resultat clau del blau de metilè | 5 micrograms per mL, cap colònia el dia 1 | El mateix nivell, 3.2 vegades 10 elevat a 4 a les 24 hores; combinacions amb azitromicina o rifampicina a zero | Taxa de resposta, taxa de recaiguda, esdeveniments adversos |
| Prova formal de sinergia | No es va fer | No es va fer | Determinació de dosis i comparació controlada |
La taula resumeix el punt central d'aquest article. Tot el que queda a l'esquerra de l'última columna és treball en cultiu. Res de cap dels dos articles no correspon a l'última columna.
Bartonella no és Borrelia
Tots dos articles esmenten Borrelia burgdorferi, l'espiroqueta de la malaltia de Lyme, perquè l'assaig amb colorants provenia de treballs anteriors sobre Borrelia en fase estacionària del mateix laboratori, en què el blau de metilè i la daptomicina també havien donat resultats positius. Aquests antecedents són un context útil i una font habitual d'errors.
Cap experiment de cap dels dos articles sobre Bartonella no compara directament Borrelia amb Bartonella. Els organismes són diferents, els medis són diferents, les concentracions són diferents, i l'efecte hipotètic del blau de metilè sobre la membrana de Bartonella es va presentar com una especulació que requeria més estudi. Els resultats no s'han d'extrapolar entre espècies, i cap dels dos articles no dona suport a afirmacions generals sobre paràsits. La comparació de les cèl·lules persistents de Borrelia i Bartonella manté separades les dues literatures per aquest motiu.
Per què els cultius no es converteixen en un protocol
L'interès de cerca en un protocol de blau de metilè per a Bartonella és comprensible. Aquests articles expliquen per què aquesta expressió s'ha de tractar com un senyal d'alerta i no com una llista de la compra.
En primer lloc, 5 micrograms per mL en un pou no són una prescripció. Aquesta concentració no incorpora informació sobre absorció, distribució, unió a proteïnes, penetració intracel·lular ni tolerabilitat. Els autors la van triar com una mitjana aproximada dels pics dels antibiòtics i van indicar que els estudis futurs haurien d'utilitzar cada fàrmac al seu propi nivell realista.
En segon lloc, zero colònies vol dir cap colònia en aquelles condicions de sembra en placa, no teixit estèril. Les cèl·lules persistents, els bacteris intracel·lulars i les limitacions del mostreig queden fora de la placa d'agar.
En tercer lloc, les combinacions que esterilitzen un pou poden fallar o causar danys dins d'un cos. L'azitromicina amb blau de metilè i la rifampicina amb blau de metilè són combinacions de laboratori a exposicions de laboratori. Sense farmacocinètica en animals i dades controlades en humans, no hi ha cap dosi, cap durada ni cap relació benefici-risc establertes. Qualsevol persona que estigui valorant opcions hauria de parlar-ne amb un professional mèdic i revisar quan l'ús del blau de metilè requereix supervisió mèdica abans d'extreure cap conclusió de les dades en plaques de cultiu.
La conclusió limitada que sí que avalen aquests articles és aquesta: el blau de metilè té una activitat reproduïble contra B. henselae JK53 sense creixement in vitro, també en combinacions de dos fàrmacs al laboratori, i els resultats més sòlids de combinacions i de cèl·lules derivades de biopel·lícules provenen de l'estudi de 2020. Tota la resta, inclòs si aquesta activitat és rellevant per a la bartonel·losi humana, continua sense haver-se provat.