Agar EMB versus agar MacConkey: selecció i interpretació dels medis

Un estudiant sembra per esgotament la mateixa mostra d'aigua en dues plaques. En una, apareixen colònies fosques amb una lluentor metàl·lica verda. En l'altra, apareixen colònies de color rosa viu amb un halo tèrbol. Les dues plaques es van inocular a partir del mateix tub, es van incubar una al costat de l'altra i es van llegir a la mateixa hora. L'estudiant pregunta quina placa és correcta.

Totes dues plaques són correctes. Responen preguntes diferents. La confusió apareix quan els dos medis es tracten com si fossin proves intercanviables per detectar bacteris intestinals. Comparteixen un objectiu: seleccionar organismes entèrics gramnegatius i separar els fermentadors de lactosa dels no fermentadors, però ho fan amb una química diferent i una lògica visual diferent. Quan s'entenen aquests dos conceptes de base, la selecció de la placa i la lectura de les colònies esdevenen rutinàries.

La resposta breu

L'agar EMB utilitza dos colorants, eosina Y i blau de metilè, que compleixen una doble funció: inhibeixen el creixement dels grampositius i precipiten al voltant dels productors intensos d'àcid per formar colònies fosques, clàssicament amb una lluentor metàl·lica verda en Escherichia coli. L'agar MacConkey separa aquestes funcions: les sals biliars més el violeta de cristall inhibeixen els grampositius, la lactosa alimenta la fermentació i el vermell neutre indica la presència d'àcid mitjançant colònies roses o vermelles. Si l'objectiu és una demostració presumptiva visualment marcada d'E. coli, l'EMB és una bona opció. Si l'objectiu és separar clarament fermentadors de lactosa rosats de no fermentadors incolors, especialment en fluxos de treball amb femta o orina, el MacConkey sol ser més fàcil d'interpretar. Cap de les dues plaques identifica un organisme només pel color.

EMB: colorants que seleccionen i indiquen alhora

El concepte de l'EMB integra la selecció i la indicació en les mateixes molècules. El protocol d'agar eosina-blau de metilè de l'ASM descriu l'EMB com un medi alhora selectiu i diferencial, en què la parella de colorants inhibeix molts organismes grampositius mentre que la fermentació de la lactosa afavoreix la captació i la precipitació dels colorants. Una formulació Levine estàndard conté peptona, lactosa, fosfat, eosina Y, blau de metilè i agar, tal com es detalla en el mètode BAM de la FDA per a l'agar EMB de Levine. Tingueu en compte que algunes receptes antigues d'EMB afegien sacarosa juntament amb lactosa, mentre que l'EMB de Levine conté lactosa sense sacarosa; per tant, registreu quina formulació utilitza el vostre laboratori.

Llegir l'EMB significa interpretar el comportament dels colorants. Una fermentació vigorosa de la lactosa produeix prou àcid per provocar una precipitació intensa dels colorants, cosa que confereix a E. coli centres de color blau fosc a negre i, en el cas clàssic, una lluentor metàl·lica verda sota llum reflectida. Els fermentadors més febles, com Enterobacter i Klebsiella, solen créixer com a colònies mucoides de color rosa a porpra sense aquesta lluentor. Els no fermentadors, com Salmonella, Shigella i Proteus, generalment creixen com a colònies incolores o translúcides perquè no produeixen el pic d'acidesa que precipita els colorants. Els grampositius solen quedar inhibides, tot i que el grau d'inhibició varia segons la soca i el producte. La química completa de la preparació dels colorants, inclòs el motiu pel qual el blau de metilè es comporta en primer lloc com un colorant catiònic, correspon a una discussió separada sobre formulacions de colorants, i el context general de microscòpia es troba en un atles de mètodes de tinció. Aquest article se centra en la selecció i la lectura de les plaques.

La figura anterior és il·lustrativa. Mostra la lògica visual que cal esperar: colònies fosques amb lluentor, tipus mucoides rosats i tipus pàl·lids en EMB, en comparació amb tipus rosats i pàl·lids en MacConkey. Utilitzeu-la per aprendre el patró i, després, confirmeu cada interpretació amb controls fotografiats i amb el prospecte del producte corresponent al medi exacte que teniu al banc de treball.

MacConkey: funcions separades, regla visual més simple

El concepte del MacConkey assigna cada funció a un ingredient diferent. El protocol d'agar MacConkey de l'ASM presenta el mateix enfocament selectiu i diferencial, i el mètode BAM de la FDA per a l'agar MacConkey enumera els components funcionals: peptones, lactosa, sals biliars, sal, vermell neutre, violeta de cristall i agar. Les sals biliars més el violeta de cristall seleccionen contra els grampositius. La lactosa aporta el substrat de fermentació. El vermell neutre actua com a indicador de pH i es torna rosa o vermell allà on es forma àcid, de vegades amb bilis precipitada al voltant dels fermentadors intensos.

La regla de lectura és deliberadament simple: rosa significa fermentador de lactosa; incolor o pàl·lid significa no fermentador. E. coli apareix de color rosa a vermell, sovint amb un halo de precipitat biliar. Klebsiella i Enterobacter apareixen de color rosa i sovint són mucoides a causa de les seves càpsules. Salmonella, Shigella, Proteus i molts altres bacils gramnegatius apareixen incolors. Un avantatge addicional és rellevant als laboratoris docents: les sals biliars generalment redueixen el fenomen d'eixamenament de Proteus, de manera que és més fàcil obtenir colònies aïllades en MacConkey que en medis no selectius, tot i que la inhibició no és absoluta i hi ha alternatives sense sal quan el control de l'eixamenament és la prioritat.

La raó molecular per la qual els colorants es comporten d'aquesta manera depèn de la càrrega i de l'estructura. El blau de metilè és un colorant fenotiazínic catiònic, i la seva estructura i propietats expliquen la seva afinitat per les superfícies bacterianes àcides, la mateixa afinitat que intervé quan precipita en zones àcides de l'EMB.

Comparació d'un cop d'ull

Llegiu la taula com un procediment de decisió. Quan l'exercici requereix que els estudiants visualitzin un gradient d'intensitat de fermentació amb un extrem especialment marcat, l'EMB el mostra. Quan l'exercici requereix una classificació binària ràpida abans de la confirmació bioquímica, el MacConkey la mostra.

Quin medi per a cada mostra

Per a exercicis amb aigua orientats al reconeixement presumptiu de coliformes fecals o E. coli, l'EMB resulta atractiu perquè la lluentor és visualment distintiva. El MacConkey també permet treballar amb gramnegatius entèrics i s'ha utilitzat històricament en anàlisi d'aigua, però cap de les dues plaques substitueix un mètode reglamentari d'anàlisi d'aigua, que pot especificar medis com mTEC modificat o MI segons la prova. Consulteu el mètode que el vostre laboratori està obligat a seguir.

Per a separacions de tipus fecal entre fermentadors i no fermentadors, el MacConkey sol ser el més útil dels dos. El treball pràctic amb femta per detectar Salmonella o Shigella normalment incorpora medis entèrics més selectius, com XLD o Hektoen enteric, en lloc de dependre només del MacConkey.

Per a pràctiques amb orina que imiten un flux de treball clínic, combineu MacConkey amb agar sang. El MacConkey proporciona una primera classificació dels gramnegatius, mentre que l'agar sang recupera organismes que el MacConkey inhibeix. Aquesta combinació és habitual en les descripcions clíniques de la preparació de cultius d'orina.

Per ensenyar purament el concepte, utilitzeu tots dos. L'EMB ensenya que la intensitat de la fermentació importa i que una sola molècula pot exercir dues funcions. El MacConkey ensenya un disseny modular: selector, substrat i indicador es mantenen separats. Els estudiants que sembren costat per costat una E. coli coneguda, una Klebsiella aerogenes coneguda i una Salmonella coneguda en tots dos medis rarament tornen a confondre'n les dues lògiques.

Errors de lectura que es repeteixen cada curs

L'error més habitual és identificar per color i prou. Una colònia rosa en MacConkey pot ser E. coli, Klebsiella, Enterobacter o un altre fermentador. Una colònia incolora pot ser Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas o un altre no fermentador. El color és un fenotip de cribratge que orienta les proves de confirmació, com ara tinció de Gram, oxidasa, panells bioquímics o identificació instrumental; no és un nom d'espècie.

El segon error és donar massa importància a l'absència de lluentor. Algunes colònies reals d'E. coli, especialment les aïllades, produeixen poca o cap lluentor metàl·lica en EMB. L'absència de lluentor no exclou E. coli, i la seva presència no la confirma. Tracteu la lluentor com una pista presumptiva.

El tercer error és comparar plaques d'edats diferents. Els fermentadors tardans de lactosa poden tornar-se rosats en MacConkey després d'una incubació prolongada, cosa que difumina la separació clara entre fermentadors i no fermentadors. Feu la lectura a l'hora especificada pel laboratori i registreu el temps d'incubació juntament amb el resultat.

El quart error és interpretar un creixement mixt com si fos un sol organisme. Una colònia rosa al costat d'una colònia incolora representa dos fenotips, no pas un d'intermedi. Seleccioneu colònies ben aïllades i treballeu cada morfotip per separat. La textura mucoide crea una trampa semblant: tant Klebsiella com Enterobacter poden tenir aspecte mucoide, de manera que la càpsula per si sola no determina mai la identificació. L'organisme que abans s'ensenyava com Enterobacter aerogenes ara es classifica com Klebsiella aerogenes, fet que explica per què les taules antigues i les etiquetes més noves semblen discrepar.

Controls i una regla final

Utilitzeu controls fotografiats o frescos en cada sessió: E. coli per a la reacció de fermentador intens, Klebsiella aerogenes per a la fermentació mucoide sense la lluentor clàssica, una soca de Salmonella per a la reacció incolora de no fermentador i Staphylococcus aureus per confirmar la inhibició dels grampositius en el vostre producte concret. Ajusteu els números de soca i els criteris d'acceptació al prospecte del fabricant, perquè la selectivitat varia segons el contingut de bilis, violeta de cristall i colorants.

Recordeu una frase al banc de treball. L'EMB utilitza colorants que alhora seleccionen i indiquen, cosa que proporciona un senyal molt marcat d'E. coli a canvi d'una lectura més subtil. El MacConkey separa la selecció de la indicació, cosa que proporciona una classificació clara entre rosa i pàl·lid a canvi de menys detall sobre la fermentació. Trieu el medi el concepte del qual s'ajusti a la pregunta, confirmeu el color amb les proves adequades i les dues plaques deixaran de competir i començaran a complementar-se.