Tumačenje izgleda kolonija E. coli i drugih bakterija na EMB agaru

Student zasije nepoznati mikroorganizam metodom iscrpljivanja na eozin-metilensko plavi agar, inkubira ga preko noći i zatim zatekne ploču s tamnim kolonijama koje imaju zeleni odsjaj. U bilježnicu upisuje „E. coli, potvrđeno.“ Taj zapis tvrdi više nego što ploča može potkrijepiti. Ploča pokazuje fenotip rasta i fermentacije u određenim uslovima. Identitet vrste zasebna je tvrdnja koja zahtijeva zasebne dokaze.

Ovaj vodič pristupa rezultatima na EMB agaru kao zadatku tumačenja. Objašnjava osnovni princip, vodi kroz ilustrativni atlas ploča s kontrolama i navodi slučajeve u kojima udžbenički prikaz može dovesti do pogrešnog zaključka.

Princip na kojem se zasniva ploča

EMB agar je i selektivan i diferencijalan. Boje eozin Y i metilensko plavo suzbijaju mnoge gram-pozitivne mikroorganizme, pa podloga pogoduje rastu gram-negativnih mikroorganizama. Iste boje djeluju kao indikatori: kada mikroorganizam fermentira dostupni šećer i lokalno proizvede dovoljno kiseline, kolonija intenzivno veže boju i postaje tamnoljubičasta do plavocrna. Pri intenzivnom stvaranju kiseline na površini kolonije može se pojaviti metalnozeleni prelijevajući sjaj. ASM protokol za ploče s eozin-metilensko plavim agarom opisuje ovu kombinaciju selekcije i diferencijacije te pruža referentne fotografije za nastavu.

Prije tumačenja bilo kojeg rezultata važan je jedan detalj: provjerite koja se formulacija koristi. Starija formulacija Holt Harris Teague sadrži laktozu i saharozu, dok Levine EMB sadrži samo laktozu. Mikroorganizam koji fermentira saharozu, ali ne i laktozu, kao što je slučaj s mnogim izolatima Serratia marcescens, može izgledati drugačije na ove dvije verzije podloge. Dokumentacija proizvođača za EMB podloge izričito navodi ovu razliku u formulaciji. U bilježnicu uz rezultat zapišite proizvođača i formulaciju.

Pripremljeni, neinokulirani EMB agar obično je crvenosmeđ do crvenkastoljubičast, ponekad sa zelenkastom nijansom ili sitnim talogom. Ta pozadinska boja nije rast. Svako očitanje uporedite s neinokuliranom pločom ili dokumentiranim početnim izgledom, a primarnu ploču očitajte nakon približno 18 do 24 sata aerobne inkubacije na 35 do 37 C, osim ako nastavni protokol ne propisuje drugačije. Produžena inkubacija može promijeniti izgled povezan s fermentacijom.

Kako pregledati ploču

Koristite dvije vrste osvjetljenja. Najprije pregledajte ploču pod reflektiranom ili koso usmjerenom svjetlošću i nagnite je: metalni sjaj se prelijeva i može se pojaviti ili nestati zavisno od ugla posmatranja. Zatim je pregledajte pod propuštenom svjetlošću kako biste procijenili boju kolonija i tamna središta. Procjenu zasnivajte na dobro izoliranim kolonijama jer gust rast i susjedne kolonije mijenjaju lokalno nakupljanje kiseline i mogu oslabiti ili pojačati boju. ASM zbirka slika to direktno pokazuje: E. coli u mješovitoj kulturi može izgubiti očekivani sjaj jer okolni mikroorganizmi mijenjaju kiselost sredine.

Uključite kontrole kad god vježba to dopušta. Uobičajeni nastavni skup obuhvata E. coli ATCC 25922 za fenotip plavocrne boje i metalnog sjaja, nefermentirajući mikroorganizam kao što je Salmonella Typhimurium ATCC 14028 ili Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 za bezbojni fenotip te gram-pozitivni mikroorganizam kao što je Enterococcus faecalis ili Staphylococcus aureus kao kontrolu inhibicije, kako je navedeno u standardnim tabelama kontrole kvaliteta za EMB podloge. Ako pozitivna kontrola nema sjaj, prvo posumnjajte na inkubaciju, gust rast ili formulaciju, a tek onda na nepoznati mikroorganizam.

Ilustrativni atlas ploča

Ploče u nastavku su generirane ilustracije, a ne fotografije stvarnih kultura. Prikazuju obrazac koji treba tražiti, a ne tačnu nijansu bilo kojeg pojedinačnog soja. Uporedite ih s ASM referentnim fotografijama i sa stvarnim pločama iz nastavnog laboratorija.

Ploča 1: Escherichia coli na EMB agaru, intenzivna fermentacija laktoze

E. coli na EMB agaru obično je tamnoljubičasta do plavocrna, često s tamnim središtem i metalnozelenim sjajem koji nastaje zbog intenzivnog stvaranja kiseline. Sjaj je poznati nalaz koji studenti traže, ali ga smatrajte potpornim dokazom, a ne definicijom. Intenzitet sjaja varira zavisno od soja, trajanja inkubacije, gustoće kolonija i ugla posmatranja. Odsustvo sjaja ne isključuje E. coli, a tamna kolonija bez sjaja upućuje na nekoliko drugih mikroorganizama koji fermentiraju. Za svaki daljnji rad odaberite dobro izoliranu koloniju umjesto da tumačite gusti sektor rasta.

Ploča 2: Klebsiella pneumoniae na EMB agaru, mukoidne kolonije uz fermentaciju

Klebsiella pneumoniae na EMB agaru obično stvara velike, sjajne, mukoidne kolonije u ružičastoljubičastim do smeđeljubičastim nijansama, često s tamnim središtima, ali uglavnom bez izraženog metalnog sjaja. Slična morfologija javlja se kod srodnih mikroorganizama koji fermentiraju, kao što je Enterobacter. Mukoidna tekstura i veličina kolonije dio su tumačenja: mala i pljosnata ružičasta kolonija ima drugačiju interpretativnu vrijednost od velike, kupolaste mukoidne kolonije. Kao i kod E. coli, ploča upućuje na fenotip fermentacije, a imenovanje na nivou vrste zahtijeva biohemijsku potvrdu opisanu u nastavku.

Ploča 3: Salmonella na EMB agaru i drugi nefermentirajući mikroorganizmi, bezbojne kolonije

Salmonella na EMB agaru i srodni mikroorganizmi koji ne fermentiraju laktozu, uključujući Shigella i mnoge izolate Pseudomonas, obično rastu u obliku bezbojnih do prozirnih ili blijedojantarnih kolonija. Neke formulacije i uslovi daju blagu ružičastu nijansu, pa blijedoružičasta kolonija ne znači automatski da mikroorganizam fermentira. EMB ne razlikuje Salmonella od Shigella ili od drugih nefermentirajućih mikroorganizama; ta se razlika utvrđuje kasnijim testovima. Imajte na umu i da su dokumentirani sojevi Salmonella koji fermentiraju laktozu i stvaraju metalno sjajne kolonije nalik kolonijama E. coli, što je još jedan razlog zbog kojeg jedna ploča ne može dati konačan odgovor.

Ploča 4: Serratia marcescens i zamka formulacije

Serratia marcescens zaslužuje vlastiti odjeljak jer studenti često očekuju crvene kolonije, a zatim pogrešno protumače ploču. Većina kliničkih izolata ne fermentira laktozu, pa na Levine EMB podlozi obično izgledaju blijedo do slabo obojeno. Budući da mnogi izolati fermentiraju saharozu, formulacija koja sadrži saharozu može dati tamniju ili izraženiju reakciju povezanu sa stvaranjem kiseline. Ne očekujte ni karakteristični crveni pigment prodigiozin na 35 do 37 C; stvaranje pigmenta nepouzdano je na temperaturi inkubatora. Kada protokol navodi Serratia marcescens na EMB agaru, provjerite na koju se formulaciju tvrdnja odnosi. Pregled metabolizma Serratia sažima obrazac nefermentiranja laktoze i promjenjivog fermentiranja saharoze koji stoji iza ove zamke.

Ploča 5: kontrole i inhibirani mikroorganizmi

Gram-pozitivni mikroorganizmi kao što su Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus i Bacillus uglavnom su inhibirani ili im je rast izrazito suzbijen na EMB agaru, iako inhibicija nije potpuna kod svakog soja. Skup kontrola omogućava pouzdano tumačenje: kontrola E. coli treba pokazati dobar rast s plavocrnom bojom i sjajem, kontrola nefermentirajućeg mikroorganizma treba pokazati bezbojan rast, a kontrola inhibicije treba pokazati slab rast ili odsustvo rasta. Ako kontrola inhibicije dobro raste, selekcija nije uspjela i sva ostala očitanja na toj seriji podloge su upitna. Metode bojenja odgovaraju na drugačije pitanje od podloga za kultivaciju; za laboratorijski rad s bojenjem preparata pogledajte atlas bojenja metilenskim plavim.

Poređenje uz ograničenja

Tri rečenice sažimaju izglede koji mogu zavarati. Tamna boja ne znači E. coli jer Klebsiella, Enterobacter i drugi mikroorganizmi koji fermentiraju razvijaju tamna središta bez sjaja. Ružičasta boja ne znači Klebsiella jer mikroorganizmi s umjerenom ili sporom fermentacijom te neki koji se uobičajeno smatraju nefermentirajućim izgledaju ružičasto ili svijetloljubičasto. Sjaj ne znači konačnu identifikaciju E. coli jer ga mogu stvarati i drugi mikroorganizmi s intenzivnom fermentacijom. Nastavni protokol i njegovi prikazi mješovitih kultura ilustriraju svaku od ovih pogrešnih pretpostavki.

Ograničenja potvrde

EMB agar pokazuje fenotip, a ne vrstu. Različiti mikroorganizmi mogu imati isti izgled kolonija, a jedan mikroorganizam može odstupati od udžbeničkog prikaza zavisno od soja, starosti, gustoće rasta, formulacije i inkubacije. Zato se u nastavnim i kliničkim postupcima morfologija na EMB agaru smatra preliminarnim pokazateljem.

Utemeljen postupak za studenta je sljedeći: opišite izoliranu koloniju (veličinu, boju, središte, sjaj pod koso usmjerenom svjetlošću, mukoidnost), zabilježite formulaciju, trajanje i temperaturu inkubacije te kontrole; zatim presijavanjem dobro izolirane kolonije dobijte čistu kulturu prije bilo kojeg potvrdnog testa. Uobičajeni daljnji postupci uključuju bojenje po Gramu i IMViC reakcije za preliminarnu identifikaciju E. coli i koliformnih bakterija, TSI ili KIA te biohemijske panele specifične za mikroorganizam kod enteričnih mikroorganizama, uz serološku identifikaciju, MALDI TOF ili druge validirane metode identifikacije kada to zadatak zahtijeva. Za osnovne informacije o mjestu EMB agara među selektivnim i diferencijalnim podlogama za enterične mikroorganizme pogledajte uvode u podloge za kultivaciju enteričnih mikroorganizama i daljnje ispitivanje bojenjem po Gramu. Za povezano pitanje o tome šta plavo bojenje preparata može, a šta ne može dokazati, atlas bojenja metilenskim plavim na isti način razdvaja zapažanje od zaključka.

Zapišite zapažanje prije zaključka. „Tamne plavocrne kolonije sa zelenim sjajem koji zavisi od ugla posmatranja na Levine EMB podlozi nakon 24 sata, u skladu s intenzivnom fermentacijom laktoze“ utemeljen je zapis. „E. coli, potvrđeno“ zahtijeva korak potvrde koji sama ploča ne može pružiti.