Članak
Test redukcije metilenskog plavila u mlijeku: princip i ograničenja
Studentica podiže dvije epruvete s mlijekom. U jednoj je mlijeko postalo bijelo za sat vremena. U drugoj je ostalo plavo pet sati. Pokazuje na plavu epruvetu i kaže da je to mlijeko sigurno za piće.
Taj zaključak otkriva pogrešno razumijevanje testa. Test mlijeka s metilenskim plavilom ne utvrđuje sigurnost. Pokazuje koliko brzo mikrobna populacija u toj epruveti snižava redoks potencijal u tačno određenim uslovima. Spor rezultat znači nisku ukupnu metaboličku aktivnost u uzorku. Ne govori ništa o tome koji su organizmi prisutni, ima li među njima patogena ili je li mlijeko pravilno pasterizirano.
Ta razlika je važna jer test djeluje uvjerljivo. Plava boja nestaje. Sat daje broj. Brojevi navode na zaključke koji nadilaze ono što test pokazuje. Ovaj članak objašnjava korisno tumačenje i sprečava ono koje može ugroziti sigurnost.
Šta redukcija zapravo mjeri
Metilensko plavilo je plavo u oksidiranom obliku, a gotovo bezbojno kada se reducira u leukometilensko plavilo. Svježe mlijeko sadrži otopljeni kisik, koji održava plavu boju bojila. Bakterije koje obavljaju respiraciju i fermentaciju troše taj kisik i oslobađaju reducirajuće spojeve. Kada redoks potencijal dovoljno opadne, bojilo prihvata elektrone i gubi boju. Udžbenik mikrobiologije mlijeka Univerziteta u Guelphu opisuje isti slijed: uklanjanje kisika, a zatim nastajanje reducirajućih supstanci tokom bakterijskog metabolizma.
Klasični rad u časopisu Journal of Dairy Science opisuje to kao proces u dvije faze: mikroflora prvo iscrpi kisik, a zatim sastojci mlijeka brzo reduciraju bojilo. Zato je test redukcije metilenskog plavila u mlijeku najbolje razumjeti kao funkcionalni test ukupne metaboličke aktivnosti, a ne kao metodu brojanja ćelija. Redoks ponašanje metilenskog plavila objašnjava hemiju koja stoji iza te promjene.
Kisik poništava završnu promjenu. Reducirani leukooblik bojila izložen zraku ponovo oksidira i postaje plav. Mućkanje, prelijevanje, široke epruvete i veliki zračni prostor iznad uzorka zato odgađaju rezultat. Tanak plavi prsten često ostaje na površini u dodiru sa zrakom nakon što se ostatak sadržaja epruvete obezboji. Standardni postupci prihvataju taj prsten umjesto da čekaju da i on nestane.
Vrsta organizama uvodi dodatno odstupanje. Koliformne bakterije i mnogi mikroorganizmi mliječno-kiselinskog vrenja brzo reduciraju bojilo. Mnogi psihrotrofni i termodurni mikroorganizmi reduciraju ga sporo ili gotovo nikako. Dva uzorka mlijeka s istim brojem mikroorganizama utvrđenim na ploči mogu izgubiti plavu boju u razmaku od nekoliko sati. Već ta činjenica isključuje pretvaranje vremena u broj kolonija.
Kontrolisani laboratorijski postupak
Terenske verzije i verzije iz udžbenika razlikuju se u detaljima, pa je rezultat važeći samo u okviru metode kojom je dobijen. Uobičajena verzija za laboratorij za ispitivanje hrane provodi se ovako:
- Uzmite uzorak sirovog mlijeka uz minimalnu aeraciju i odmah ga ohladite. Prije izdvajanja uzorka za testiranje promiješajte ga blagim okretanjem posude.
- U sterilnu epruvetu odmjerite 10 mL mlijeka i 1 mL radne otopine bojila. Jedna od često korištenih radnih koncentracija je 0.005 posto bojila, uz omjer mlijeka i bojila 10 prema 1.
- Začepite epruvetu, blago je preokrenite dva puta i u roku od nekoliko minuta stavite u vodeno kupatilo. Uobičajena temperatura inkubacije je 35 do 38 stepeni Celzijusa, zavisno od konkretnog standarda. Zabilježite koji standard primjenjujete.
- Tokom inkubacije zaštitite epruvete od svjetlosti jer svjetlost ubrzava redukciju.
- Očitajte rezultat nakon 30 minuta, a zatim u utvrđenim intervalima. Krajnja tačka je vrijeme kada se boja sadržaja epruvete podudari s referentnim uzorkom prokuhanog mlijeka ili kada dostigne stepen gubitka boje definisan postupkom.
- Ako metoda zahtijeva vizuelnu kontrolu, sačuvajte epruvetu s istim mlijekom bez dodanog bojila.
FAO priručnik za ispitivanje mlijeka daje izričitu terensku verziju ovog postupka: 10 mL mlijeka uz 1 mL bojila, začepljivanje, blago preokretanje, inkubacija na približno 37 do 38 stepeni i očitavanje svakih 30 minuta. U kontrolnim epruvetama koristi se prokuhano mlijeko kako bi se uništio prirodni reducirajući sistem i osigurala referenca za poređenje boje.
Gornja shema definiše uslove koji moraju biti kontrolisani. Iste zapremine, isto bojilo, ista temperatura, isto miješanje, ista zaštita od svjetlosti i isto pravilo za određivanje krajnje tačke. Promijenite bilo koji od tih uslova i promijenit će se i izmjereno vrijeme. Zato kućne verzije koje koriste proizvoljnu koncentraciju bojila nisu uporedive s laboratorijskim ocjenama.
Na šta ukazuje vrijeme redukcije
Duže vrijeme znači nižu ukupnu aktivnost u navedenim uslovima. Kraće vrijeme znači višu ukupnu aktivnost. Nastavne tabele iz oblasti mljekarstva povezuju ta vremena s okvirnim ocjenama, naprimjer 5 ili više sati kao vrlo dobro i manje od 30 minuta kao loše u jednoj shemi izvedenoj iz BIS standarda.
Pouka je u razlikama među shemama. Rezultat od 5 sati nema univerzalnu ocjenu. Pripada postupku koji ga je definisao. Zato je opravdan sljedeći oblik izvještavanja:
MBRT iznosi X sati prema navedenoj metodi, što odgovara ocjeni prema toj metodi.
Nikada se ne navodi da MBRT iznosi X jedinica koje formiraju kolonije po mL. Smjernice izvedene iz publikacije Standard Methods navode da se rezultati redukcije bojila ne trebaju iskazivati kao broj bakterija. Postupak jednostavnog bojenja metilenskim plavilom također odgovara na drugo pitanje jer pokazuje oblik ćelija pod mikroskopom, a ne ukupnu aktivnost u epruveti.
Tabela tumačenja i ograničenja
Ova tabela je izvorni referentni pregled za članak. Pročitajte svaki red u cijelosti. Nijedna ćelija ne može se tumačiti zasebno.
| Zapažanje ili tvrdnja | Na šta ukazuje | Šta ne može dokazati | Glavni ometajući faktori |
|---|---|---|---|
| Brz gubitak plave boje, za manje od 2 sata prema jednoj shemi za sirovo mlijeko | Visoka reducirajuća aktivnost, u skladu s velikim mikrobnim opterećenjem ili slabom održivošću mlijeka pri čuvanju | Vrste, tačan broj, toksine ili neuspješnu pasterizaciju | Čuvanje na toplom, mikroflora bogata koliformnim bakterijama, svjetlost, mala količina bojila |
| Srednje vrijeme, 2 do 4 sata | Umjerena aktivnost; ocjena važi samo u okviru navedene sheme | Sigurnost ili odsustvo sporih reduktora | Visoka temperatura inkubacije, razlike u aeraciji, izdvajanje masti |
| Spora redukcija, 5 ili više sati | Niska ukupna aktivnost prema toj shemi | Odsustvo patogena, provedenu pasterizaciju ili hemijsku sigurnost | Ostaci antibiotika, konzervansi, dodatni otopljeni kisik, velika količina bojila |
| Plavi prsten ostaje na površini dok se ostatak sadržaja obezboji | Ponovna oksidacija na granici sa zrakom, normalan rubni efekat | Neuspješan test ili nepotpunu reakciju | Široka epruveta, labav čep, ponovljeno otvaranje radi pregleda |
| Bijeli sadržaj epruvete nakon inkubacije zagrijanog mlijeka | Izmijenjen reducirajući sistem uz aktivnost preživjelih mikroorganizama | Da je zagrijavanje bilo ekvivalentno validiranoj pasterizaciji | Oštećenje toplotom, oporavak tokom inkubacije, naknadna kontaminacija |
| Bilo koja pojedinačna vrijednost MBRT navedena bez metode | Nepoznate uslove testa | Bilo koju ocjenu ili broj | Formulacija bojila, omjer, temperatura, miješanje i pravilo za određivanje krajnje tačke nisu navedeni |
Provjere zasnovane na rastu, poput uzgoja bakterija na hranjivim podlogama, ostaju način za određivanje broja i izolaciju. Epruveta za redukciju služi za preliminarnu provjeru. Ploča omogućava identifikaciju i brojanje.
Šta test ne može dokazati o sigurnosti
Spor rezultat ne može dokazati odsustvo patogena. Patogen prisutan u količini koja je klinički značajna može malo doprinijeti ukupnoj potrošnji kisika. Otkrivanje patogena zahtijeva metode specifične za određene organizme, što aktuelna publikacija Standard Methods obrađuje kao područje odvojeno od opće preliminarne provjere kvaliteta.
Test ne može potvrditi pasterizaciju. Provjera toplotne obrade provodi se testom alkalne fosfataze ili drugom validiranom metodom prema smjernicama Codexa za higijenu mlijeka i mliječnih proizvoda. Bijeli ili plavi sadržaj epruvete ne govori ništa o trajanju i temperaturi obrade serije.
Test ne može potvrditi sigurnost hrane. Sigurnost zavisi od patogena, prethodno nastalih toksina, ostataka lijekova, hemijskih kontaminanata, historije hladnog lanca i kontaminacije nakon uzorkovanja. Codex sigurnost mlijeka i mliječnih proizvoda tretira kao lanac kontrolnih mjera, a ne kao jedan rezultat preliminarne provjere.
Uslovi laboratorija za ispitivanje hrane razlikuju se od kućnog testiranja
U mljekarskom laboratoriju test služi za preliminarnu provjeru mlijeka pri prijemu, poređenje dobavljača tokom vremena ili podučavanje redoks mikrobiologije pod nadzorom. Uzorci su sljedivi. Reagensi su standardizovani. Temperature se bilježe. Otpad se zbrinjava prema laboratorijskim postupcima.
Kućno testiranje nema ništa od toga. Zapremine odmjerene u kuhinji su približne. Koncentracije bojila koja se prodaju na internetu znatno variraju. Inkubacija se često odvija u toploj prostoriji umjesto u kalibrisanom vodenom kupatilu. Promjena boje ipak se dešava, pa rezultat djeluje pouzdano iako nedostaju svi kontrolisani uslovi koji mu daju značenje.
Veći rizik proizlazi iz ponašanja. Plavi sadržaj epruvete kod kuće navodi na pijenje sirovog mlijeka koje bi laboratorij i dalje poslao na određivanje broja mikroorganizama na pločama, provjere patogena i ostataka. Test mlijeka s metilenskim plavilom osmišljen je za ocjenjivanje sirovog mlijeka pri prijemu, a ne za odobravanje mlijeka za konzumaciju. Brža preliminarna provjera rezazurinom ima isto ograničenje: brže očitavanje boje i dalje ne daje odgovor o patogenima.
Sažeto pravilo za laboratorijski rad
Standardizujte bojilo, omjer, temperaturu, miješanje, svjetlost i krajnju tačku. Navedite vrijeme uz naziv metode i ocjenu. Tumačite izmjereno vrijeme uz historiju čuvanja, vrstu mikroflore, ostatke i kvalitet uzorkovanja. Kratko vrijeme ukazuje na aktivnost koju treba istražiti. Dugo vrijeme nikada ne potvrđuje sigurnost.