Metilensko plavo i upalna signalizacija: inflamasomi, IL-6 i STAT3

Pretpostavimo da tri laboratorija izvijeste da isti plavi spoj djeluje protuupalno. Jedan pokazuje manje IL-1beta iz makrofaga. Drugi pokazuje manje enzima iNOS u istom tipu ćelija. Treći pokazuje manje IL-6 u krvi i manju aktivnost STAT3 u mozgu. Primamljivo je spojiti ta tri rezultata u jednu tvrdnju. Takvo spajanje prikriva sam nalaz.

Svaki rezultat pripada drugačijem konceptu signalizacije, s vlastitim okidačem, korakom sastavljanja i mjerenim pokazateljem. Metilensko plavo djeluje na svaki od tih procesa u različitoj tački. Pitanje poboljšava li išta od toga zdravstveni ishod zasebno je pitanje, obrađeno u našem pregledu metilenskog plavog i upale. Ova stranica bavi se signalnim putevima.

Put 1: sastavljanje inflamasoma i kaspaza-1

Inflamasom je proteinska struktura koja se prema potrebi gradi unutar mijeloidne ćelije. Njegovi dijelovi su senzor, adaptorski protein nazvan ASC i efektorski enzim nazvan kaspaza-1. Nakon sastavljanja, kaspaza-1 cijepa pro-IL-1beta i pro-IL-18 u njihove oblike koji se izlučuju te može pokrenuti piroptozu, upalni oblik ćelijske smrti. Senzor određuje tip: NLRP3 reaguje na kristale i toksine koji stvaraju pore, kao što su nigericin i ATP, NLRC4 reaguje na bakterijski flagelin, AIM2 reaguje na dvolančanu DNK u citosolu, a nekanonski put reaguje na unutarćelijski lipopolisaharid.

Za aktivaciju su potrebna dva signala. Prvi signal je priprema: ligand receptora sličnog Toll-u pokreće transkripciju NLRP3 i pro-IL-1beta ovisnu o NF-kB, čime nastaju potrebni dijelovi. Drugi signal je sastavljanje: drugi okidač uzrokuje oligomerizaciju ASC-a u tačkaste nakupine, cijepanje kaspaze-1 u njen fragment p20 i oslobađanje zrelog IL-1beta p17. Poznato je da mitohondrijske reaktivne vrste kisika i unos kristala doprinose drugom signalu za NLRP3.

Studija iz 2017. o širokoj inhibiciji inflamasoma u makrofagima ispitala je metilensko plavo u oba signalna koraka. U makrofagima iz mišje koštane srži pripremljenim lipopolisaharidom, nigericin, ATP i kristali mononatrijevog urata pojedinačno su izazvali oslobađanje IL-1beta i kaspaze-1 te stvaranje tačkastih nakupina ASC-a. Metilensko plavo u koncentracijama od 20 do 200 mikromolara smanjilo je sva tri pokazatelja ovisno o dozi, bez ubijanja ćelija. Flagelin i Salmonella za NLRC4, dvolančana DNK i Listeria za AIM2 te lipopolisaharid unesen transfekcijom ili živa E. coli za nekanonski put pokazali su isti obrazac. Sam spoj nije pokrenuo oslobađanje, a kontrolne ploče nisu pokazale antibakterijski učinak, pa se rezultat odnosi na odgovor domaćina.

Uzvodno su izmjerena tri učinka intervencije. Metilensko plavo smanjilo je mitohondrijski superoksid izazvan rotenonom, a s njim se smanjilo i oslobađanje IL-1beta potaknuto rotenonom. Smanjio se unos fluorescentnih kuglica, što je u skladu sa smanjenom fagocitozom prije prepoznavanja kristala. Reporterski konstrukt pod kontrolom promotora NLRP3 s dva vezna mjesta za NF-kB pokazao je manju aktivnost uz metilensko plavo, dok skraćeni promotor bez tih mjesta nije reagovao. U epruveti bez ćelija metilensko plavo također je direktno smanjilo aktivnost rekombinantne ljudske kaspaze-1. Dodavanje spoja samo tokom pripreme ili samo tokom aktivacije i dalje je smanjivalo oslobađanje IL-1beta, IL-18 i kaspaze-1, što znači da su uključena oba koraka.

Ispitivanja na miševima pokazala su istu selektivnost. Smrtonosna doza lipopolisaharida usmrtila je kontrolne životinje u roku od nekoliko sati, dok je metilensko plavo povećalo preživljavanje; peritonealni IL-1beta se smanjio, ali IL-6 u istoj tečnosti nije. U modelu peritonitisa izazvanog bakterijom Listeria, peritonealni IL-1beta se smanjio, dok je ukupan broj ćelija ostao nepromijenjen. Ljudski monociti THP-1 ponašali su se poput mišjih makrofaga kod sva četiri tipa inflamasoma. Nalaz o inflamasomu objašnjava sazrijevanje IL-1beta i IL-18, a ne svakog citokina. Zato i oblik imunoloških ćelija mozga u eksperimentima s mikroglijom i astrocitima odgovara na drugačije pitanje od sastavljanja proteinske strukture.

Put 2: transkripcija iNOS-a putem vezivanja NF-kB i STAT1

Inducibilna sintaza azotnog oksida, odnosno iNOS, jedva je prisutna u stanju mirovanja, a njena transkripcija odvija se prema potrebi. Lipopolisaharid je potiče uglavnom putem razgradnje IkB-alpha, nakon čega slijede fosforilacija NF-kB i njegov ulazak u jedro. Interferon-gamma je potiče uglavnom putem fosforilacije STAT1 koju provodi Janus kinaza, nakon čega STAT1 ulazi u jedro. Svaki faktor zatim se veže za svoje mjesto na promotoru iNOS-a. Aktivnost enzima i indukcija gena zasebne su kontrolne tačke, a lijek može djelovati na jednu ili na obje.

Studija iz 2015. o indukciji iNOS-a u makrofagima i miševima s endotoksemijom utvrdila je učinak na nivou glasničke RNK. U ćelijama RAW 264.7 i primarnim mišjim makrofagima, metilensko plavo u koncentraciji od 1 mikromolara, dodano 30 minuta prije lipopolisaharida, interferon-gamma ili oba, smanjilo je protein iNOS i njegovu mRNA tokom 8 do 24 sata, uz manje nitrita u mediju i bez gubitka vijabilnosti. Kod miševa koji su primili 25 mg po kg lipopolisaharida, jednokratna doza od 5 mg po kg, primijenjena jedan sat ranije, smanjila je protein iNOS i njegovu mRNA u plućima, jetri i srcu.

Posebno je značajno ono što se nije promijenilo. Razgradnja IkB-alpha, fosforilacija NF-kB, fosforilacija STAT1 i nakupljanje oba faktora u jedru ostali su nepromijenjeni. Poremećaj se javio jedan korak kasnije: ekstrakti jedra pokazali su manje vezivanja NF-kB za njegov element DNK nakon lipopolisaharida i manje vezivanja STAT1 nakon interferon-gamma, a imunoprecipitacija hromatina potvrdila je manju zauzetost promotora iNOS-a svakim od tih faktora unutar ćelija. Smanjio se i faktor nekroze tumora alfa, čiji promotor također koristi NF-kB. Faktori su bili aktivirani i stigli su u jedro, ali su se slabije vezivali za ciljnu DNK.

Uočite razliku u odnosu na put 1. Ovdje je riječ o vezivanju faktora za DNK, koristi se STAT1 umjesto STAT3, a mjere se mRNA, protein i nitrit umjesto tačkastih nakupina ASC-a i fragmenata kaspaze-1. Naša mapa ciljnih mjesta metilenskog plavog u ćelijskim modelima odvaja ovaj transkripcijski nivo od direktnih mjerenja enzima i mitohondrijskih procesa.

Put 3: serumski IL-6 i aktivacija STAT3 u tkivu

IL-6 prenosi signal putem porodice receptora gp130 u kaskadu od Janus kinaze do STAT3. Fosforilirani STAT3 stvara dimere, ulazi u jedro i pokreće upalne programe, dok je sam IL-6 cilj NF-kB, pa zajedno čine povratnu spregu koja se često naziva osovinom IL-6 do STAT3. Standardni mjereni pokazatelji su serumski IL-6 uzvodno, omjer fosforiliranog i ukupnog STAT3 te efektorski enzimi poput iNOS-a i COX2 nizvodno.

Studija iz 2023. na miševima o IL-6 i STAT3 nakon lipopolisaharida ispitala je ovu osovinu u različitim biološkim odjeljcima. Mužjaci miševa C57BL/6 primali su 1 mg po kg lipopolisaharida dnevno tokom tri dana, uz 5 ili 10 mg po kg metilenskog plavog 30 minuta nakon svake doze. Trećeg dana serumski IL-6 bio je niži u obje grupe koje su primale metilensko plavo nego u grupi koja je primala samo lipopolisaharid, dok se većina drugih citokina u ispitivanom panelu nije promijenila uz tretman. Omjeri fosforiliranog i ukupnog STAT3 bili su niži u moždanoj kori, hipokampusu i koži uha, uz slabije bojenje mikroglije na Iba-1, niže nivoe iNOS-a i COX2 te djelimično ublažen gubitak tjelesne mase.

Ovdje su potrebne dvije napomene. Niži serumski IL-6 zajedno s manjom fosforilacijom STAT3 u tkivu odgovara modulaciji osovine, ali ne izdvaja primarnu tačku djelovanja, jer manje uzvodnog citokina, slabija receptorska signalizacija ili promijenjena aktivnost fosfataza pojedinačno mogu proizvesti isti omjer. Osim toga, tjelesna masa tokom tri dana akutnog izlaganja pokazatelj je na nivou cijele životinje, a ne ocjena simptoma ili remisije. Taj pokazatelj daje kontekst izvan rezultata imunoblota, ali ne pretvara nalaz o signalizaciji u tvrdnju o liječenju. Zasebni hemijski procesi mitohondrijske redoks regulacije odvijaju se paralelno s ovim citokinskim procesima i ne treba ih spajati s njima.

Poređenje puteva: tačke djelovanja i mjereni pokazatelji

Tabela sprečava tri nevaljana prenošenja zaključaka. Nalaz o tačkastim nakupinama ASC-a ne dokazuje nalaz o STAT3. Nalaz o vezivanju STAT1 za promotor iNOS-a ne dokazuje nalaz o STAT3, iako oba proteina pripadaju porodici STAT. Nalaz o serumskom IL-6 ne dokazuje smanjeno sastavljanje inflamasoma: u peritonealnom eksperimentu IL-1beta se smanjio, dok IL-6 nije. Svaki red zahtijeva vlastiti okidač i mjereni pokazatelj, zbog čega čitanje ćelijskih, životinjskih i kliničkih studija o metilenskom plavom zahtijeva povezivanje svake tvrdnje s nivoom na kojem je provedeno mjerenje.

Ništa od ovoga ne utvrđuje doziranje, sigurnost ili korist kod ljudi. Modeli s lipopolisaharidom služe kao kontrolisani okidači za ispitivanje mehanizma, a ne kao replike hronične bolesti. Primjena doze uz okidač ispituje sprečavanje izazvane promjene, a ne povlačenje već razvijene bolesti. Ovaj prikaz mehanizama držite odvojenim od ishoda kod pacijenata, a svaku zdravstvenu tvrdnju procjenjujte na osnovu studije na pacijentima koja je potkrepljuje.