Metilensko plavilo u istraživanjima zebrica: dodatak pri uzgoju i ometajući faktor u eksperimentu

Voda za jaja zebrica često je blago plava, a gotovo niko ne bilježi zašto. Bojilo je metilensko plavilo, dodano protiv gljivica, i većina protokola tretira ga kao pozadinski uslov. Pozadinski uslov ovdje je pogrešan pojam. Bolji je neprijavljeni eksperimentalni faktor: nešto što je prisutno u tretiranim posudama, a odsutno u kontrolnim, farmakološki aktivno pri korištenim koncentracijama i sposobno promijeniti upravo one ishode koje eksperiment mjeri.

Ta razlika određuje sve što slijedi. Rutinska upotreba protiv gljivica pri uzgoju jedno je pitanje. Da li je taj dodatak neutralan u odnosu na vaš test, drugo je pitanje. Novija literatura o zebricama na prvo daje umirujući odgovor, a na drugo zabrinjavajući.

Šta smjernice zapravo propisuju

Ne postoji jedinstven standard, što je dio problema. Smjernice Kanadskog vijeća za brigu o životinjama dopuštaju 0.5 mg/L, odnosno 0.00005%, u rastvoru za transport jaja i larvi radi smanjenja rasta gljivica. Evropske smjernice za laboratorijske životinje opisuju embrije koji se drže u mediju koji često sadrži istih 0.00005%. Recept za E3 medij laboratorije Cold Spring Harbor propisuje dvostruko više, 1 mg/L ili 0.0001%, kao sastojak recepta. Nasuprot tome stoji upadljivo izostavljanje: OECD-ova smjernica za test toksičnosti na ribljim embrijima propisuje rekonstituiranu vodu za razrjeđivanje i ispitivanu hemikaliju, bez preporuke za metilensko plavilo, ni u verziji iz 2013. ni u kasnijoj reviziji. Tako jedna laboratorija uzgaja embrije zebrica u plavoj vodi s metilenskim plavilom od prvih sati života, druga provodi regulatorni test na embrijima u bistroj vodi, a obje svoj medij nazivaju uobičajenim. Svako ko poredi rezultate različitih laboratorija ili objedinjuje historijske kontrolne podatke preuzima tu nedosljednost.

Radi boljeg razumijevanja koncentracija, 0.00005% iznosi približno 1.56 mikromolara, a 0.0001% približno 3.13 mikromolara. To su male vrijednosti i primamljivo ih je protumačiti kao preniske da bi bile važne. Studije u nastavku provjeravaju upravo tu pretpostavku, pri upravo tim koncentracijama.

Čitaoci koji dolaze iz akvaristike, a ne iz laboratorije, susreću istu molekulu u drugačijem okruženju, opisanom u akvarističkom vodiču za metilensko plavilo. Hemija je ista; objašnjenje kako bojilo prenosi elektrone kroz ćelije pokazuje zašto se redoks-aktivan spoj stalno pojavljuje u radovima o metabolizmu. Ono što slijedi odnosi se posebno na vodu za jaja zebrica s metilenskim plavilom.

Metabolizam: smjer efekta mijenja se s razvojnom fazom

Najinformativnija studija izlagala je zebrice koje se normalno razvijaju od prvog dana života do 5 dana nakon oplodnje i mjerila oksidativni metabolizam u svakoj fazi, kako opisuje objavljeni izvještaj o eksperimentima s metabolizmom embrija. Obrazac treba pažljivo opisati jer se njegov smjer preokreće.

1 dan nakon oplodnje bazalna potrošnja kisika porasla je kod izloženih embrija pri obje koncentracije koje se koriste pri uzgoju. Nakon 2 dana potencijal mitohondrijske membrane u površinskom sloju larvi bio je povišen pri izlaganju koncentracijama od 0.00005%, 0.0001% i 0.0003%. Do 4 do 5 dana, nakon izlijeganja, smjer se preokrenuo: oksidativna potrošnja energije opala je, bez obzira na to je li izlaganje bilo kontinuirano od oplodnje ili akutno, samo od 3. do 4. dana. Istovremeno su se smanjile količine transkripata za podjedinice mitohondrijskih respiratornih kompleksa i nakon 1 i nakon 4 dana, zajedno s transkriptima povezanim sa steroidogenezom i glukoneogenezom.

Još dva zapažanja upotpunjuju sliku. Izlijeganje je počelo nešto ranije pri višoj koncentraciji koja se koristi pri uzgoju: izloženi embriji prednjačili su nakon 2 dana, a kontrolni su ih sustigli do 3. dana. Sama osovina odgovora na stres djelovala je očuvano: kada su larve stare 5 dana izložene stresoru u obliku vrtloženja, nivo kortizola u cijelom tijelu normalno je porastao u obje grupe. Dakle, bojilo pri ovim dozama nije opći razvojni otrov i ne prigušuje svaki fiziološki odgovor. Ono mijenja energetski metabolizam zavisno od razvojne faze, povećava ga prije izlijeganja, a smanjuje nakon njega.

Ponašanje: zašto se dvije studije ne slažu i zašto obje mogu biti tačne

Literatura o ponašanju djeluje proturječno dok se načini izlaganja ne uporede jedan uz drugi. Jedna studija razvojne i bihevioralne sigurnosti izlagala je embrije od približno 6 sati nakon oplodnje koncentracijama do 10 mikromolara, svakodnevno obnavljala rastvore do 4. dana, zatim prebacila larve u medij bez bojila tokom 5. i 6. dana i testirala lokomociju u testu svjetlo-tama 6. dana. Rezultat: nije bilo značajnog efekta na smrtnost, izlijeganje ili morfologiju, niti efekta tretmana na lokomociju. Autori su opravdano preporučili 10 mikromolara kao gornju granicu u svojim uslovima.

Druga grupa, čiji su neki autori učestvovali i u studiji metabolizma, provela je izlaganje onako kako se ono zaista odvija pri uzgoju: bojilo je bilo prisutno od 2 do 3 sata nakon oplodnje uz svakodnevno djelimično obnavljanje, a ponašanje je mjereno tokom izlaganja ili ubrzo nakon njega. Pri istim rutinskim koncentracijama larve su pokazale smanjenu lokomociju u 24-satnom testu, što se moglo ponoviti kod različitih sojeva i u različitim laboratorijama, a studija ometanja bihevioralnih mjerenja povezala je taj efekat sa serotonergičkim tonusom, u skladu s poznatom inhibicijom monoamin-oksidaze koju uzrokuje bojilo. Najznačajnije je to što je medij za embrije koji sadrži metilensko plavilo prikrio očekivani lokomotorni odgovor na fluoksetin, lijek iz grupe SSRI. Skrining test proveden u plavoj vodi stoga može propustiti efekat lijeka koji bi bistra voda otkrila.

Nema stvarne proturječnosti. Spoj može u jednom testu ne ostaviti nikakav mjerljiv preostali efekat dva dana nakon uklanjanja, a ipak biti aktivan dok je prisutan u drugom. Praktično tumačenje glasi: negativni rezultat opravdava gornju granicu koncentracije, a ne tvrdnju o neutralnosti, dok pozitivni rezultat opisuje važan rizik: aktivno izlaganje tokom perioda mjerenja, u upravo onim uslovima koje koristi većina laboratorija.

Redoks bojilo u redoks testu

Još jedna zamka zaslužuje zaseban odlomak jer narušava sam sistem mjerenja, a ne životinju. Test potrošnje energije Alamar Blue i sam se zasniva na redoks hemiji: rezazurin se reducira u fluorescentni rezorufin. Metilensko plavilo također učestvuje u redoks hemiji. U kontrolama bez ćelija obje koncentracije koje se koriste pri uzgoju blago su, ali značajno, smanjile fluorescenciju Alamar Blue nakon 24 sata. U eksperimentima na životinjama izloženi embriji isprani su najmanje tri puta u mediju bez bojila prije testa, a biološki efekat kod izleglih larvi bio je veći od interferencije u sistemu bez ćelija. Stoga su obje tvrdnje tačne: kod ispranih životinja ostaje stvarni metabolički efekat, a neisprano bojilo povrh toga stvara direktan hemijski artefakt. Kontrole moraju razdvojiti ta dva efekta, inače nijedna vrijednost nema smisla. Opće smjernice za tumačenje rezultata testova zasnovanih na bojilima ovdje su posebno važne.

Vremenski pregled razvojnih faza

Originalni prikaz za ovaj članak. Koncentracije su dvije standardne vrijednosti koje se koriste pri uzgoju, 0.00005% i 0.0001%, osim ako je drugačije navedeno.

Obrazac koji treba zapamtiti jeste rani porast, a zatim pad metaboličkih pokazatelja, uz bihevioralne efekte prisutne tokom izlaganja i nemjerljive nakon uklanjanja spoja iz organizma u jedinom testu koji je to ispitao.

Kontrolna lista za planiranje kontrola

Drugi originalni prikaz. Koristite ga kada se protokoli za zebrice s metilenskim plavilom primjenjuju u eksperimentu.

1. Prijavite bojilo kao reagens, a ne kao vodu. Navedite koncentraciju i u procentima i u mikromolarima, početak i kraj izlaganja u satima ili danima nakon oplodnje, raspored obnavljanja i period uklanjanja bojila prije svakog mjerenja.
2. Uskladite kontrole s istraživačkim pitanjem. Studija ispitivane hemikalije treba kontrole bez bojila; studija postupaka uzgoja treba grupe bez bojila i s bojilom, uz bilježenje ishoda djelovanja protiv gljivica, jer nijedna citirana studija nije mjerila efikasnost protiv gljivica.
3. Isperite prije redoks testova, pa provjerite. Isperite najmanje tri puta u mediju bez bojila i paralelno provedite kontrolu bez ćelija koja sadrži bojilo i reagens, jer bojilo direktno smanjuje signal Alamar Blue.
4. Tretirajte bihevioralne i monoaminske ishode kao visokorizične. Studije lokomocije, reakcije na iznenadni podražaj, ponašanja nalik anksioznosti, antidepresiva i inhibitora MAO trebaju izbjegavati bojilo tokom mjerenja ili dokazati neutralnost za konkretni ishod; period uklanjanja bojila od jednog do dva dana uklonio je jedan lokomotorni efekat, ali to nije dokazano za druge eksperimentalne paradigme.
5. Tretirajte metaboličke i mitohondrijske ishode kao visokorizične u svakoj fazi. Potrošnja kisika, potrošnja energije, membranski potencijal i količine transkripata respiratornog lanca mijenjaju se pri koncentracijama koje se koriste pri uzgoju, u suprotnim smjerovima prije i nakon izlijeganja.
6. Ne prenosite zaključak o neutralnosti s jednog eksperimentalnog pristupa na drugi. Negativni rezultat nakon uklanjanja bojila ne odnosi se na kontinuirano izlaganje; negativni morfološki rezultat ne odnosi se na metabolizam ili interakciju s lijekom; rezultat za jedan soj, temperaturu ili trajanje testa ne odnosi se na druge.
7. Navedite smjernicu koju ste slijedili i njenu alternativu. Izričito navedite koncentracije prema CCAC-u, evropskim smjernicama ili laboratoriji Cold Spring Harbor i napomenite da OECD-ov test na embrijima izostavlja bojilo, kako bi čitalac mogao razumjeti uslove u kojima su vaše životinje držane.

Ništa od ovoga nije argument protiv upotrebe bojila da bi se jaja održala živim. To je argument protiv toga da se izbor postupka uzgoja neispitan prenese u podatke. Plavo u posudi potiče od molekule s farmakološkim djelovanjem, a eksperimenti koji će najvjerovatnije biti iskrivljeni upravo su metabolički i neurobihevioralni skrininzi velikog kapaciteta, za koje se danas prednost daje mladim zebricama. Zabilježite ga, kontrolirajte njegov utjecaj, uklonite ga prije mjerenja i provjerite test u kojem bi moglo neprimjetno učestvovati.