Testovi kvasca s metilenskim plavilom: brojanje živih ćelija naspram mjerenja vremena respiracije

Na laboratorijskom stolu stoje dvije epruvete. Obje su plave. U jednoj, plave ćelije pod mikroskopom označavaju mrtvi kvasac. U drugoj, prelazak sadržaja epruvete iz plavog u bezbojno znači da je kvasac živ i da respirira. Ista boja, suprotna tumačenja. Zamijenite ova dva testa i svaki zaključak postaje obrnut.

Cijeli članak govori o toj razlici. Metilensko plavilo je redoks boja: u oksidiranom obliku je plavo, a u reduciranom obliku je bezbojno leukometilensko plavilo. Brojanje vijabilnih ćelija koristi tu hemiju u kratkom mikroskopskom pregledu. Eksperiment respiracije koristi je u reakciji cijelog uzorka čije se trajanje mjeri. Svaki zahtijeva vlastiti protokol, vlastite kontrole i vlastiti kritički pristup.

Brojanje vijabilnih ćelija: kratko bojenje i pravovremeno očitavanje

Protokol koji se koristi u pivarstvu najstandardiziranija je verzija. Pripremite 0.01% w/v metilenskog plavila u 2% natrijevog citrata, pomiješajte ga sa suspenzijom kvasca u omjeru 1:1 i pregledajte smjesu nakon kratkog, unaprijed određenog intervala. Objavljeni intervali variraju od 1 do 2 minute u priručniku instituta Brewing Science Institute do približno 5 minuta u istraživačkim protokolima, dok OIV metoda za mikrobiologiju vina zahtijeva pregled unutar 10 minuta. Konačna koncentracija boje u smjesi za brojanje iznosi približno 0.005%. Napunite poboljšanu Neubauerovu komoru i pri približno 400x klasificirajte tamnoplave ćelije kao nevijabilne, a neobojene ćelije kao vijabilne. Svijetloplave ćelije u OIV metodi računaju se kao žive, što već ukazuje na problem subjektivnosti o kojem se govori u nastavku.

Koncentracija ćelija izračunava se na osnovu geometrije komore. Kada se prebroji cijeli centralni kvadrat od 1 mm, broj ćelija po mL jednak je N puta faktor razrjeđenja puta 10^4, pri čemu je N broj ćelija u toj površini, kako je navedeno u ASBC metodama za kvasac. Vijabilnost se računa jednostavnije: broj neobojenih ćelija podijeljen ukupnim brojem ćelija, puta 100. Za procjenu vijabilnosti prebrojite približno 400 ćelija, u skladu sa FEMS studijom poređenja metoda u pivarstvu i OIV praksom. Dosljedno primjenjujte jedno pravilo za granične linije, naprimjer uključujte ćelije na donjim i lijevim linijama mreže, a isključujte one na gornjim i desnim.

Pravilo za pupoljke mora se odrediti prije početka brojanja. Prema uobičajenoj konvenciji, pupoljak se broji kao zasebna ćelija kada dostigne približno polovinu veličine matične ćelije, a ako je manji, broji se zajedno s matičnom ćelijom. Koje god pravilo odaberete, primijenite ga na svaki kvadrat i zapišite ga na radni list kako bi ga sljedeća osoba mogla ponoviti.

Radni list za brojanje (odštampajte)

Ovaj radni list je originalni materijal izrađen za ovaj članak. Prepišite ga u bilježnicu ili odštampajte po jedan za svaki uzorak.

Vijabilnost (%) = 100 x neobojene / (neobojene + tamnoplave). Ukupan broj ćelija po mL = N x faktor razrjeđenja x 10^4, pri čemu je N broj ćelija iz definirane površine komore. Zabilježite interval bojenja uz rezultat, jer se vrijednost vijabilnosti bez podatka o vremenu očitavanja ne može reproducirati.

Zašto se vrijednosti vijabilnosti mijenjaju

Vrijeme očitavanja prva je interferencija i djeluje u oba smjera. Metabolički aktivne ćelije reduciraju boju, pa prerano očitavanje može zateći žive ćelije prije nego što završe redukciju i pogrešno ih klasificirati kao mrtve. Međutim, produženo izlaganje samo po sebi je toksično i stvara stvarno oštećene plave ćelije, što daje lažno bojenje karakteristično za mrtve ćelije. Zato jedan laboratorijski nastavni protokol nalaže ocjenjivanje unutar 5 minuta, kako je dokumentirano u nastavnom protokolu za kvasac iz Wisconsina. Pouzdano se može reći da ocjenjivanje metilenskim plavilom zavisi od vremena, pa odredite jedan kratak interval i održavajte ga jednakim za svaki uzorak u seriji.

Uzorci niske vijabilnosti nose drugu pristranost. Standardizirana metoda upozorava da metilensko plavilo može precijeniti stvarnu vijabilnost kada je ona ispod približno 80%, jer ćelije koje još reduciraju boju ne moraju zadržati sposobnost razmnožavanja. Pivarska literatura opisuje istu nepouzdanost kada je vijabilnost znatno smanjena. Metilensko plavilo koristite kao brzu, približnu procjenu, a ključne odluke pri niskoj vijabilnosti, poput ponovnog zasijavanja kulture, potvrdite brojanjem kolonija na podlozi ili komplementarnim bojenjem.

Efekti matriksa su treći faktor. OIV metoda provodi se pri pH približno 4.6 i upozorava da snažno puferirani uzorci niskog pH sprečavaju pravilno ponašanje boje, a također ne preporučuje test pri koncentraciji šećera iznad 100 g/L, kada ćelije daju varljivo svijetloplavo očitavanje. Eksperimentalno poređenje pH pri bojenju pokazalo je znatne promjene osjetljivosti unutar ispitivanog raspona, u skladu sa studijom metode s metilenskim plavilom zavisne od pH. Ostaci su zasebna zamka: obojene čestice u kašama s mnogo nečistoća oponašaju mrtve ćelije i povećavaju varijabilnost između operatera.

Ta varijabilnost je kvantificirana, a nije samo anegdotalna. U šestomjesečnom ispitivanju u pivari, opisanom u FEMS poređenju metoda za kvasac, mjerenja metilenskim plavilom u duplikatu imala su prosječnu standardnu devijaciju od 6.1%, naspram 0.2% za protočnu citometriju s oksonolom, pri čemu su se rezultati dva operatera za isti uzorak razlikovali i do 13 procentnih poena. Kvantitativno poređenje metoda vijabilnosti iz 2023. godine pokazalo je znatno veću preciznost fluorescentne mikroskopije i protočne citometrije, uz nalaz da učinak zavisi od vrste i matriksa. Klasični opis metode autora Painting i Kirsop (PMID 24430080) ostaje referentna tačka, a širi pregled testova vijabilnosti i vitalnosti kvasca (PMID 25154541) svrstava metilensko plavilo među komplementarne, a ne konačne testove. Tripansko plavilo ovdje nije automatski bolji izbor: ono pokazuje gubitak integriteta membrane, dok metilensko plavilo pokazuje unos boje i redukcijsku aktivnost, pa se ćelije pod stresom mogu različito klasificirati pomoću ove dvije boje.

Eksperiment respiracije: mjerite vrijeme nestanka plave boje

Drugi test uopće ne koristi mikroskop. Kvasac, glukoza i razrijeđeno metilensko plavilo stavljaju se u zatvorenu epruvetu, a mjeri se vrijeme potrebno da plava boja nestane. Dok ćelije metaboliziraju, stvaraju redukcijske ekvivalente koji pretvaraju plavu boju u njen bezbojni oblik, dok je rastvoreni kisik ponovo oksidira. Kada ćelije smanje količinu kisika, neto redukcija prevlada i sadržaj epruvete se obezboji. Krajnja tačka zato odražava ravnotežu respiracije, koncentracije boje i dostupnosti kisika, te rezultat treba navesti kao vrijeme redukcije ili obezbojavanja metilenskog plavila, a ne kao direktnu brzinu potrošnje molekularnog kisika.

Koristite znatno razrijeđeniju boju nego pri ispitivanju vijabilnosti kako bi trajanje testa bilo u praktičnom vremenskom rasponu. AQA priručnik za obavezne praktične vježbe na nivou A level to dobro standardizira: 1 g glukoze na 100 mL vode zagrijane na približno 30 C, 5 g suhog kvasca dodanog neposredno prije upotrebe i radni rastvor boje koncentracije približno 0.001%, pripremljen razrjeđivanjem 0.1 mL 1% matičnog rastvora do 100 mL. Pomiješajte 2 mL suspenzije kvasca i glukoze s 2 mL radnog rastvora boje, pustite da smjesa dostigne temperaturu ispitivanja, protresite jednom tokom 10 sekundi, pokrenite mjerač vremena i nemojte ponovo tresti. Protresanje ponovo unosi kisik i vraća plavu boju sadržaju epruvete, što je najveći pojedinačni proceduralni artefakt. AQA navodi da bi se pripravak obično trebao obezbojiti unutar približno 5 minuta pri 35 C, uz prosječna vremena u ispitivanju od 275 s pri 20 C, 128 s pri 35 C i 145 s pri 45 C. To su primjeri iz jedne eksperimentalne postavke, a ne univerzalne referentne vrijednosti. Kvantitativnu vezu između brzine redukcije i metabolički aktivnog kvasca u kontroliranim uslovima podržavaju studije posvećene redukciji, uključujući rad indeksiran kao PMID 25773544 i mehanističku studiju u časopisu Yeast (2014).

Prikaz vremenskog toka (originalni materijal)

Tabela u nastavku je originalni demonstracijski prikaz izrađen za ovaj članak korištenjem prethodno opisane postavke prema AQA protokolu: 2 mL smjese kvasca i glukoze uz 2 mL radnog rastvora boje koncentracije približno 0.001%, jedno protresanje tokom 10 sekundi, a zatim inkubacija bez pomjeranja. Unosi su primjeri očitanja u formatu koji bi studentska grupa trebala bilježiti, pri čemu je indeks brzine definiran kao 1 podijeljeno vremenom obezbojavanja u sekundama. Provedite eksperiment s istim epruvetama i zamijenite ove unose izmjerenim vrijednostima.

Prikažite indeks brzine u odnosu na temperaturu za epruvete A, B i C. Krivulja raste, a zatim se izravnava ili opada, što je očekivani obrazac procesa koji pokreću enzimi, a ne prava linija. Epruvete D, E i F nisu podatkovne tačke na toj krivulji. One su kontrole koje omogućavaju njeno tumačenje.

Kontrole koje svakom testu daju smisao

Svaka serija testova respiracije treba tri prateće kontrole. Prokuhani ili usmrćeni kvasac s glukozom i bojom trebao bi ostati plav, čime se potvrđuje da brza redukcija zavisi od metabolizma živih ćelija. Živi kvasac s bojom bez dodane glukoze služi kao kontrola supstrata, ali i tada očekujte sporo obezbojavanje jer kvasac troši endogene rezerve. Glukoza s bojom bez kvasca predstavlja hemijsku slijepu probu, koja je neophodna jer glukoza u alkalnoj sredini može reducirati metilensko plavilo bez prisustva ćelija.

Brojanje vijabilnih ćelija zahtijeva drugačiju vrstu kontrole: dosljednost postupka. Isti matični rastvor boje, isti omjer miješanja, isti interval bojenja, ista površina komore, ista pravila za pupoljke i granične linije, uz brojanje bez poznavanja identiteta uzorka kad god je moguće. Kada se rezultati dva operatera razlikuju za deset poena, radni list obično otkriva uzrok: različito vrijeme očitavanja, različit prag za plavu boju ili različita pravila za pupoljke. Tehnike pripreme i pregleda obojenih ćelija povezane su s metodama jednostavnog bojenja bakterija, dok se širi pregled onoga što boja označava u različitim uzorcima nalazi u atlasu mikroskopskog bojenja. Za fizikalnu osnovu kvantitativnog očitavanja bilo kojeg intenziteta plave boje, referentni pregled apsorpcije s navedenim uslovima objašnjava zašto uz svaki koeficijent moraju biti navedeni rastvarač, pH i koncentracijski uslovi.

Odaberite test prema pitanju. Koliko je ćelija trenutno živo pitanje je brojanja, na koje se odgovara mikroskopom i radnim listom. Koliko aktivno ova kultura respirira kinetičko je pitanje, na koje se odgovara štopericom i kontroliranim epruvetama. Metilensko plavilo služi za oba, ali nikada u istoj epruveti u isto vrijeme.