Metilensko plavilo i progerija: pouke iz ćelijskog modela starenja

Promjena jednog slova u jednom genu uzrokuje starenje djece zastrašujućom brzinom. Gubitak kose, ukočeni zglobovi, sužene arterije i očekivani životni vijek koji završava u tinejdžerskim godinama. Ta bolest je Hutchinson-Gilfordov sindrom progerije, a njeno istraživanje godinama je bilo usmjereno na jedro, gdje mutirani protein izaziva oštećenja. Istraživanje Univerziteta u Marylandu iz 2016. postavilo je drugačije pitanje: kako izgledaju mitohondrije u ovim ćelijama? Odgovor je povezao dva odjeljka ćelije, a plava boja stara jedno stoljeće djelovala je na oba.

Riječ je o istraživanju Xionga i saradnika, objavljenom u časopisu Aging Cell 2016. godine. U njemu su korištene isključivo ćelije uzgojene u kulturi. Ta činjenica određuje kako treba razumjeti sve što slijedi. Nalazi su stvarni i konkretni. Jednako je konkretan i jaz između tih nalaza i bilo kakvog liječenja.

Model: jedna mutacija, jedan protein koji ostaje pričvršćen

Progerija počinje zamjenom C sa T na poziciji 1824 gena LMNA. Ta promjena ne mijenja aminokiselinu. Aktivira skriveno mjesto prekrajanja RNK, čime se iz proteina lamina A uklanja 50 aminokiselina. Skraćeni proizvod, nazvan progerin, gubi mjesto cijepanja koje bi inače omogućilo ćeliji da ukloni njegovo farnezilno sidro. Zato progerin ostaje trajno farneziliran i pričvršćen za unutrašnju membranu jedra, dok bi se normalni lamin A naizmjenično vezivao za nju i odvajao od nje.

Posljedice u jedru dobro su dokumentovane i vidljive pod mikroskopom. Jedra stvaraju izbočine i nabore umjesto da zadrže gladak ovalni oblik. Heterohromatin, gusto zbijena, neaktivna DNK koja inače oblaže rub jedra, postaje oskudniji. Hiljade gena mijenjaju ekspresiju. Zamislite jedarnu laminu kao potpornu konstrukciju iza tapeta: kada je jedan dio konstrukcije zavaren na pogrešnom mjestu, zid se izboči, a uzorak tapeta izobliči se širom prostorije.

U istraživanju su korišteni fibroblasti kože pacijenata s progerijom, zajedno s kontrolnim ćelijama s jednakim brojem pasaža, te druga linija izmijenjena tako da normalni fibroblasti direktno proizvode progerin. Izmijenjene ćelije razvile su ista oštećenja, što upućuje na progerin kao uzrok, a ne na prethodno zdravstveno stanje pacijenata ili vrijeme provedeno u kulturi. Težina oštećenja pratila je količinu: linija s većom ekspresijom progerina pokazivala je izraženija oštećenja u svim ispitivanim aspektima.

Kako su izgledale mitohondrije

Mitohondrije zdravih fibroblasta formiraju razgranatu mrežu oko jedra, sastavljenu od dugih cjevastih struktura koje se kreću duž staza citoskeleta. U linijama progerije ta mreža je nestala. Veći udio mitohondrija bio je fragmentiran, mnoge su bile otečene, a elektronska mikroskopija pokazala je približno dvostruko povećanje broja teško oštećenih organela. Snimanje u vremenskim intervalima pokazalo je da prelaze kraće udaljenosti i kreću se sporije nego u kontrolnim ćelijama.

Promjene funkcije pratile su promjene oblika. Nivoi mitohondrijskog superoksida i oksidansa u cijeloj ćeliji porasli su. Više ćelija pokazivalo je poremećen membranski potencijal. Proizvodnja ATP-a se smanjila. Ništa od toga samo po sebi nije iznenađujuće, jer oštećene mitohondrije oslobađaju reaktivne vrste kisika i proizvode manje energije. Nov je bio predloženi uzrok. PGC-1alpha, transkripcijski koaktivator koji pokreće biogenezu mitohondrija putem nizvodnih faktora kao što su NRF1, TFAM i regulatori fuzije i fisije MFN1, MFN2, OPA1, FIS1 i DRP1, bio je smanjen približno osam puta na nivou mRNK u ćelijama progerije, uz odgovarajuće smanjenje količine proteina. Činilo se da progerin potiskuje glavni prekidač za stvaranje i održavanje mitohondrija. Ta veza između oštećenja jedarne lamine i energetskog metabolizma dio je šireg objašnjenja proizvodnje energije u mitohondrijama, a oksidansi kao druga strana iste ravnoteže obrađeni su u temama oksidativnog stresa i kontrole ROS-a.

Šta je metilensko plavilo promijenilo

Istraživači su ćelije sedmicama neprekidno tretirali metilenskim plavilom u niskoj koncentraciji od 100 nanomolar. U kontekstu ćelijske kulture, to je dugo izlaganje niskoj koncentraciji, a ne kratkotrajan impuls lijeka. Metilensko plavilo prelazi između oksidiranog i reduciranog oblika i može prenositi elektrone unutar mitohondrija. Zato se opisuje kao redoks spoj koji djeluje na mitohondrije, a ne kao obični antioksidans koji se troši kada neutralizira jedan oksidans.

Mitohondrije su reagovale i u normalnim ćelijama i u ćelijama progerije. ATP je porastao, nivoi oksidansa su pali, a udio teško oštećenih mitohondrija se smanjio. Ekspresija PGC-1alpha djelimično se oporavila, zajedno s nekim njegovim nizvodnim ciljevima. Do ovog dijela riječ je o općem učinku podrške mitohondrijama, koji nije specifičan za progeriju.

Rezultati u jedru bili su iznenađenje i bili su specifični za ćelije zahvaćene bolešću. Kvantitativna analiza oblika pokazala je smanjenje izbočina jedra. Ukupne količine lamina A i C porasle su. Najupadljivija je bila preraspodjela progerina: u netretiranim ćelijama progerije samo je oko 30 posto progerina bilo u rastvorljivoj nukleoplazmatskoj frakciji, dok je ostatak bio usidren u membrani. Nakon tretmana, rastvorljivi udio porastao je na približno 65 posto, što je blizu ponašanju normalnih lamina. Kada se oslobodi membrane, progerin za sobom povlači manje susjednih proteina, a oporavile su se i rastvorljive frakcije lamina A i C.

Nakon tog oslobađanja poboljšale su se dvije fenotipske osobine jedra. Heterohromatin uz rub jedra, ispitan elektronskom mikroskopijom i bojenjem na heterohromatinski protein HP1-alpha, bio je vidljivo obnovljen. Sekvenciranje RNK pokazalo je i da se transkriptom vraća prema normalnom stanju: netretirane ćelije progerije razlikovale su se od kontrolnih u više od 3,200 gena, dok su se tretirane ćelije progerije razlikovale u približno 1,670. U normalnim ćelijama isti tretman promijenio je samo nekoliko desetina gena, što govori u prilog tome da je učinak na jedro povezan s progerinom, a ne s općom naglom promjenom transkripcije. Princip da istraživanja na ćelijama i životinjama odgovaraju na uža pitanja nego što njihovi naslovi sugerišu objašnjen je u članku kako čitati istraživanja o metilenskom plavilu.

Zašto ovo nije liječenje

Četiri ograničenja zadržavaju ovo istraživanje tamo gdje pripada: u laboratoriji.

Prvo, sve se odvijalo u posudama. Fibroblasti u kulturi nemaju krvnu opskrbu, kontekst imunog sistema, strukturu tkiva ni farmakološke procese cijelog organizma koji određuju hoće li spoj uopće stići do cilja. U ovom radu nijednoj životinji nije data doza i nijedan pacijent nije liječen.

Drugo, fibroblasti progerije model su jednog tipa ćelija. Bolest dovodi do smrti prvenstveno kroz promjene u arterijama, kostima i masnom tkivu, a istraživanje je ispitalo samo fibroblaste i jedan preparat glatkih mišićnih ćelija. Druga tkiva mogu se ponašati drugačije.

Treće, oporavak jedra uslijedio je nakon sedmica neprekidnog izlaganja nanomolarnoj koncentraciji u mediju za kulturu. Koncentracije u posudi nisu doze i ništa u radu ne pretvara 100 nanomolar u mediju u režim primjene kod ljudi. Metilensko plavilo ima vlastiti odnos između doze i odgovora te sigurnosni profil u drugim medicinskim primjenama, a ovo istraživanje ne daje osnovu za kućnu upotrebu. Opći sigurnosni kontekst obrađen je u članku sigurnost i nuspojave metilenskog plavila.

Četvrto, progerija nije normalno starenje. To je rijetka bolest uzrokovana jednom mutacijom, u kojoj se potporna konstrukcija jedra oštećuje na specifičan način. Spoj koji ublažava to konkretno oštećenje u ćelijama uzgojenim u kulturi govori malo o starenju ljudi bez te mutacije. Ćelijski fenotip omogućava uvid u međudjelovanje jedra i mitohondrija, ali nije rezultat koji pokazuje dugovječnost.

Zato sažetak koji vjerno odražava nalaze mora biti uslovan. U fibroblastima progerije, progerin potiskuje PGC-1alpha i ostavlja mitohondrije fragmentiranim, usporenim, s visokim nivoima oksidansa i manjkom energije. Metilensko plavilo u niskoj koncentraciji obnovilo je mjerene pokazatelje funkcije mitohondrija u svim ćelijama i dodatno oslobodilo progerin s membrane jedra u ćelijama zahvaćenim bolešću, uz djelimičan oporavak oblika jedra, heterohromatina i ekspresije gena. Zbog tog dvostrukog djelovanja vrijedi poznavati ovo istraživanje. Ono ne čini metilensko plavilo terapijom za progeriju ili starenje.