Metilensko plavilo za bojenje DNA i RNA: primjena u gelovima i na membranama

Student provodi elektroforezu na agaroznom gelu, boji ga metilenskim plavilom i ne vidi ništa tamo gdje je očekivao jasnu traku. Za susjednim laboratorijskim stolom, postdoktorand boji Northern membranu bojom iz iste plave bočice i za tri minute dobija oštre ribosomske trake. Student zaključuje da postupak s gelom nije uspio. Postupak s gelom je uspio. Ta dva zadatka bila su različita, a ista boja daje odgovore uz različitu osjetljivost, različitu pozadinu i različita pravila za naredne korake.

Bojenje DNA i bojenje RNA metilenskim plavilom imaju zajedničku hemijsku osnovu, ali različitu svrhu. U gelu boja pokazuje koliko se nukleinske kiseline nalazi unutar porozne matrice. Na membrani pokazuje je li prijenos uspio i jesu li u staze unesene jednake količine uzorka. Kada se ta razlika razjasni, postaju jasni i protokoli, granice detekcije i ograničenja kompatibilnosti.

Kratak odgovor

Metilensko plavilo je planarna kationska boja koja se za nukleinske kiseline veže nekovalentno i reverzibilno, kombinacijom elektrostatičkog privlačenja prema fosfatnim grupama, interkalacije između parova baza i vezivanja u malom žlijebu. Upravo je ta reverzibilnost ključna. Trake se mogu obojiti i pregledati pod vidljivom svjetlošću, dokumentovati, a zatim se boja može ukloniti ili uzorak pročistiti za kloniranje, hibridizaciju ili ponovno ispitivanje sondom.

Za bojenje dvolančane DNA metilenskim plavilom u agaroznom gelu, standardni brzi postupak koristi 0.02 posto w/v (200 mikrograma po mL) u vodi, oko 15 minuta bojenja i oko 15 minuta uklanjanja boje vodom, uz pregled na transiluminatoru s bijelom svjetlošću. Za membrane, klasični postupak za Northern blot koristi 0.02 do 0.04 posto boje u natrijevom acetatu pri pH oko 5.2, nekoliko minuta bojenja nakon prijenosa i imobilizacije, a zatim ispiranje vodom i potpuno uklanjanje boje prije hibridizacije. Osjetljivost je skromna: desetine do stotine nanograma po traci u gelu pod dobrim uslovima, dok konzervativni vodiči navode 0.5 do 1 mikrogram. To je za više redova veličine iznad granica detekcije etidij-bromida i SYBR boja. Za membrane ne postoji korisna jedinstvena granica detekcije pojedinačnog transkripta jer boja uglavnom prikazuje obilnu ribosomsku RNA i ukupnu količinu unesenog materijala. Ni u jednom postupku nemojte koristiti maloprodajnu otopinu dodatka prehrani kao zamjenu. Validirane metode podrazumijevaju boju analitičke čistoće, definisane pufere i rukovanje bez RNaza kada se radi s RNA.

Kako vezivanje djeluje i gdje može zavesti

Koristan model ima tri dijela. Prvo, pozitivno nabijeni prstenasti sistem privlači negativno nabijena fosfatna okosnica. Spektroskopska istraživanja pokazuju da je ovaj elektrostatički doprinos dominantan pri niskim koncentracijama soli, dok modeliranje i molekularna dinamika potvrđuju interkalaciju i vezivanje u malom žlijebu kao stabilne načine vezivanja za dvolančanu DNA, kako je sažeto u spektroskopskom istraživanju vezivanja metilenskog plavila za DNA. Drugo, postoji određena sklonost prema GC sekvencama: modeliranje daje prednost koracima CpG i GpC, a eksperimenti pokazuju preferencijalno vezivanje za duplekse bogate GC parovima u istraživanju preferencija interkalacije metilenskog plavila, ali se boja veže i za AT duplekse. Rutinsko bojenje nije specifično za sekvencu. Treće, jednolančana DNA i RNA vežu se uglavnom elektrostatičkim interakcijama i slaganjem s dostupnim bazama i dupleksnim regijama, zbog čega intenzitet bojenja zavisi od dužine, sekvence i sekundarne strukture.

Iz toga slijede dvije posljedice. Budući da je vezivanje nekovalentno, boja se ispire. Trake u poliakrilamidu brzo blijede ako nisu namjerno fiksirane, a posebna varijanta trajne fiksacije postoji upravo zato što je uobičajeno bojenje privremeno, kako opisuju Soto i Draper za PAGE gelove. Budući da je boja fotosenzibilizator, dugo i intenzivno osvjetljavanje obojene DNA u prisustvu kisika može oksidirati guanin i na kraju izazvati prekide pojedinačnih lanaca, što je mehanizam detaljno opisan u istraživanju oksidacije guanina fotosenzibilizirane metilenskim plavilom. Kratak pregled pod bijelom svjetlošću izbjegava dobro poznata UV oštećenja iz klasičnih postupaka s etidij-bromidom, a ta prednost je stvarna pri preparativnom izdvajanju DNA. Vidljiva svjetlost je blaža, ali nije bezopasna. Osvjetljavanje treba biti kratko kada će se DNA koristiti za kloniranje. Za širu fotohemijsku osnovu ovog upozorenja pogledajte dva puta u fotohemiji metilenskog plavila. Za redoks par i stanja naboja koja objašnjavaju zašto se oksidirani oblik veže, a reducirani ne, pogledajte hemiju strukture i svojstava metilenskog plavila.

Prvi zadatak: bojenje unutar gelova

Bojenje gela odgovara na jedno pitanje: ima li u ovoj traci dovoljno nukleinske kiseline da se vidi golim okom. Dvolančana DNA u agarozi najbolje je okarakterisan slučaj. Izvorna metoda bojenja gelova metilenskim plavilom koju su razvili Flores i saradnici validirala je brzi protokol s 0.02 posto boje na 1 posto agaroze i pokazala uspješno izdvajanje i naknadno kloniranje. Isti protokol dobavljača nalazi se na stranici proizvoda metilenskog plavila kompanije IBI Scientific, gdje su jedan pored drugog navedeni postupak za membrane s 0.04 posto boje i brza varijanta za gelove.

Praktični postupak:

1. Provedite elektroforezu na gelu na uobičajen način. Bojite nakon elektroforeze, a ne tokom nje, osim ako su prijenos ili razlučivanje validirani za izmijenjenu metodu.
2. Uronite gel u 0.02 posto w/v metilenskog plavila u destilovanoj vodi, uz blago protresanje, na oko 15 minuta.
3. Uklanjajte boju kroz nekoliko izmjena vode, ukupno oko 15 minuta, dok se obojenost pozadine matrice ne smanji i trake ne postanu jasno vidljive.
4. Odmah fotografišite na transiluminatoru s bijelom svjetlošću.

Agaroza i poliakrilamid ponašaju se različito. Agaroza zadržava boju u matrici, pa je uklanjanje boje sporiji korak. Tanki poliakrilamidni gelovi brzo se boje, ali i brzo gube boju, što olakšava preparativno izrezivanje, a otežava arhivsku dokumentaciju. Sintetski oligonukleotidi u poliakrilamidu mogu se locirati istim postupkom s 0.02 posto boje za 20 do 30 minuta uz ponovljena ispiranja vodom, prema ustaljenim PAGE metodama tipa Current Protocols. Za preparativne oligonukleotide opisane su vrlo razrijeđene varijante s oko 0.0002 posto boje u razrijeđenom TBE tokom nekoliko sati, ali je dokazna osnova slabija.

Razlika između DNA i RNA je važna. Dvolančana DNA daje najjače strukturirano vezivanje. RNA i jednolančana DNA se boje, ali slabije i manje predvidljivo. Kod agaroznih gelova za RNA s formaldehidom većina laboratorija preskače bojenje metilenskim plavilom u gelu i prvo prenosi RNA na membranu, pa je boji tamo. Time se slab signal u gelu zamjenjuje oštrijim signalom na membrani i dobija zapis o količini unesenog uzorka.

Drugi zadatak: bojenje na membranama

Bojenje membrane odgovara na drugo pitanje: je li prijenos uspio i jesu li staze uporedive. Klasična primjena je reverzibilno bojenje Northern blota prema Herrinu i Schmidtu, prvobitno s 0.04 posto boje u 50 mM natrijevom acetatu pri pH 5.0 tokom 2 do 3 minute uz ispiranje vodom, pri čemu se boja prije hibridizacije može ukloniti razrijeđenim SDS-om u SSPE.

Široko korištena savremena varijanta provodi se ovako:

1. Prenesite RNA ili denaturisanu DNA na najlon ili nitrocelulozu, a zatim je imobilizujte UV umrežavanjem ili zagrijavanjem kako se uzorak ne bi izgubio tokom bojenja.
2. Neobavezno, ali uobičajeno: navlažite membranu u 5 posto sirćetnoj kiselini oko 15 minuta.
3. Bojite 5 do 10 minuta u 0.02 do 0.04 posto metilenskog plavila u 0.3 do 0.5 M natrijevom acetatu pri pH oko 5.2.
4. Isperite i uklanjajte boju u vodi 5 do 15 minuta, dokumentujte, a zatim uklonite preostalu boju prije hibridizacije.

Pozitivno nabijeni najlon dominira u radu s Northern blotovima. Nitroceluloza također funkcionira uz isti postupak sa sirćetnom kiselinom i acetatom. Slika se koristi za potvrdu prijenosa, poređenje traka 28S i 18S (ili 23S i 16S za bakterijsku RNA), označavanje ljestvica i standarda te vođenje približnog zapisa za normalizaciju prema ukupnoj RNA. Objavljene Northern metode kvantificiraju obojene ribosomske trake radi provjere unesene količine, uključujući istraživanje u oblasti mljekarstva koje je koristilo ribosomske trake obojene metilenskim plavilom za normalizaciju. Southern membrane mogu se vizualizirati na isti način, ali je boja daleko ustaljenija za provjeru unesene količine i prijenosa kod Northern blota, a DNA za Southern blot denaturira se prije prijenosa, pa se vrijednosti osjetljivosti iz gelova ne mogu direktno primijeniti.

Granice detekcije i pozadina: gdje plavilo zaostaje

Poređenje u nastavku namjerno je približno. Učinak boje zavisi od postotka gela, širine trake, optike i dosljednosti uklanjanja boje. Svaki broj posmatrajte kao red veličine, a ne kao specifikaciju.

Kontrola pozadine određuje je li skroman signal upotrebljiv. Slobodna boja ima intenzivnu boju, pa se kontrast postiže uklanjanjem nevezane boje bez uklanjanja vezane boje. Koncentrisanija boja rijetko povećava osjetljivost. Uglavnom produžava vrijeme uklanjanja boje. Provedite seriju razrjeđenja na istom gelu, membrani i kameri koje ćete koristiti i upotrebljavajte samo raspon u kojem integrisana gustoća signala ostaje proporcionalna unesenoj količini. Metilensko plavilo omogućava semikvantitativnu normalizaciju unesene količine. Nije kvantitativni test širokog dinamičkog raspona jer se kapacitet membrane, efikasnost prijenosa, zasićenje i uklanjanje boje razlikuju od staze do staze.

Ograničenja kompatibilnosti: šta ostaje upotrebljivo nakon bojenja

Kloniranje nakon bojenja plavilom je demonstrirano. Flores i saradnici izrezali su obojene trake iz agaroznog gela, izdvojili DNA te proveli ligaciju i transformaciju, uz prijavljeno bolje kloniranje nego nakon etidij-bromida uz UV. Vjerovatni razlog je manje fotooštećenja, a ne korist od same boje. Izlaganje bijeloj svjetlosti treba biti kratko, a izdvojenu DNA treba pročistiti uobičajenim postupkom ekstrakcije iz gela.

Za PCR i sekvenciranje dokazi su oskudniji. Preostala boja veže nukleinske kiseline, pa prije enzimskih koraka uklonite boju i pročistite uzorak. Očekuje se da pravilno pročišćena DNA iz gela obojenog plavilom bude upotrebljiva, ali tolerancija različitih polimeraza i hemijskih sistema za sekvenciranje na direktan prijenos ostataka boje nije dobro kvantificirana. Nemojte je pretpostavljati.

Hibridizacija blota je kompatibilna kada se strogo poštuje redoslijed: prijenos, imobilizacija, bojenje, dokumentovanje, uklanjanje boje, hibridizacija. Taj redoslijed je osnova metode Herrina i Schmidta. Bojenje prije prijenosa ili preskakanje uklanjanja boje predstavlja drugu metodu i zahtijeva zasebnu validaciju. Nakon uklanjanja boje, standardno uklanjanje sonde i ponovno ispitivanje sondom odvijaju se uobičajeno. Za bojenje na nivou ćelija istom porodicom boja i objašnjenje zašto se pristup za fiksirane razmaze ne može prenijeti na metode za žive ćelije, pogledajte atlas mikroskopskog bojenja.

Izrezivanje traka funkcionira za preparativnu agarozu i za PAGE oligonukleotide locirane plavilom, pod uslovom da se izbjegne varijanta trajne fiksacije. Elektroelucija nakon uklanjanja boje hemijski je vjerovatna za reverzibilno vezivanje, ali su kontrolisani podaci o prinosu specifični za metilensko plavilo oskudni. Nakon elucije uklonite soli ili provedite precipitaciju.

Problemi koji se ponavljaju

Slabo vidljive trake u gelu obično znače premalu masu za kolorimetrijsku boju, naročito kod kratkih jednolančanih ili RNA ciljnih molekula. Unesite više uzorka, koristite svježu boju, produžite bojenje prije povećavanja koncentracije i ranije prekinite uklanjanje boje. Potpuno plav gel bez kontrasta obično znači pretjerano bojenje ili premalo izmjena vode. Blijeđenje PAGE traka očekivana je posljedica hemije, a ne neuspjelo bojenje. Fotografišite brzo. Neujednačena pozadina membrane upućuje na nabore, mjehuriće, otiske prstiju, neujednačeno protresanje ili neujednačen prijenos. Bez hibridizacijske kontrole nemojte to tumačiti kao nejednake unesene količine. Razmazan i slab ribosomski obrazac može značiti degradaciju, ali i nepotpun prijenos, premalo ukupne RNA (tipične staze sadrže nekoliko do nekoliko desetina mikrograma) ili pretjerano uklanjanje boje. Boja prikazuje obilnu ribosomsku RNA. Ne prikazuje specifičan transkript. Taj zadatak pripada sondi.

Sigurnost i rukovanje bez pretjeranih tvrdnji

Metilenskim plavilom jednostavnije je rukovati nego etidij-bromidom, ali nije bezopasno. Aktuelni sigurnosno-tehnički list kompanije MilliporeSigma klasificira boju u kategoriju 4 akutne oralne toksičnosti, štetnu ako se proguta, uz odlaganje kroz odobreni sistem zbrinjavanja otpada prema sigurnosno-tehničkom listu Sigma-Aldrich za metilensko plavilo. Etidij-bromid ima stroža upozorenja o genotoksičnosti, uključujući sumnju na djelovanje na zametne ćelije u njegovom sigurnosno-tehničkom listu Sigma-Aldrich za etidij-bromid, a njegovi gelovi i otopine obično se odvajaju kao opasni hemijski otpad, kako je navedeno u vodiču kompanije Thermo Fisher za boje za nukleinske kiseline. Za obje boje slijedite sigurnosno-tehnički list i pravila ustanove. Suhu boju držite dobro zatvorenu i na suhom, radnu otopinu boje ponovo koristite samo onako kako protokol dopušta, obojene membrane čuvajte suhe između listova filter-papira i fotografišite gelove prije nego što se trake rasprše difuzijom.

Zapamtite pravilo za laboratorijski rad. Gelovi provjeravaju vidljivost pri velikoj unesenoj količini pod bijelom svjetlošću. Membrane provjeravaju prijenos i unesenu količinu prije nego što sonda obavi osjetljivi dio detekcije. Jedna boja služi za oba zadatka, uz skromnu osjetljivost, reverzibilno vezivanje i strog redoslijed koraka.