Metilensko plavilo i ALS: zašto se rezultati razlikuju među eksperimentalnim modelima

Pretražite metilensko plavilo i ALS i pronaći ćete dvije tvrdnje koje naizgled proturječe jedna drugoj. Prema jednoj, plava boja zaštitila je neurone u modelima ALS-a. Prema drugoj, nije imala nikakav učinak kod miša s ALS-om. Obje tvrdnje pozivaju se na stvarne naučne radove i oba rada vrijedi ozbiljno razmotriti. Proturječnost nestaje kada jasno navedete koncept iza svakog eksperimenta: model određuje tvrdnju.

Rezultat kod crva predstavlja tvrdnju o crvu. Rezultat kod ribe u stadiju larve predstavlja tvrdnju o ribi u stadiju larve. Nijedan nije tvrdnja o pacijentu dok je ne potkrijepe podaci o toku bolesti kod sisara. Ovaj članak upoređuje dva najčešće citirana rada kako biste mogli vidjeti zašto se njihovi odgovori razlikuju.

Dva eksperimenta u jednoj tabeli

Držite ovu tabelu otvorenom dok čitate. U njoj su prikazane sve važne razlike između studija.

Razlikuju se genetika, vrsta, put primjene, vrijeme početka primjene i ishodi. Genotip je samo jedna od pet razlika, pa ova dva rada ne mogu dokazati da metilensko plavilo selektivno djeluje na jedan put povezan s ALS-om. Dokazuju nešto uže, ali i dalje korisno: izraženo poboljšanje pri ranoj direktnoj izloženosti u jednostavnim modelima nije se prenijelo na tok bolesti kod sisara uz hroničnu oralnu primjenu.

Pozitivan rezultat: šta je pokazala studija na crvima i ribama

U studiji na crvima i ribama iz 2012. godine mutirani ljudski TDP-43 ili FUS eksprimiran je u motornim neuronima crva, a mutirana ljudska mRNA ubrizgana je u riblje embrije. To su modeli proteotoksičnosti. Oni tokom nekoliko dana reproduciraju toksične učinke mutiranog proteina na kretanje i oblik neurona, a ne cjelokupan višegodišnji tok ALS-a kod odraslih ljudi.

Tretman je počeo vrlo rano. Crvi su od izlijeganja rasli na agaru koji je sadržavao metilensko plavilo. Riblji embriji bili su preko noći u rastvoru lijeka, počevši od 24 sata nakon oplodnje, a ponašanje je testirano otprilike dva dana kasnije. Između lijeka i neurona nije stajala krvno-moždana barijera na način na koji postoji kod sisara, a koncentracija lijeka u plazmi ili mozgu nije mjerena.

U tim uslovima učinci su bili veliki i dosljedni. I 6 i 60 μM smanjili su paralizu povezanu s dobi kod crva s TDP-43 i FUS. Na 12. dan odraslog stadija približno 80 posto netretiranih crva s TDP-43 bilo je paralizirano, naspram oko 10 posto crva tretiranih od izlijeganja. Sinaptički test ukazao je na isto: crvi s TDP-43 bili su preosjetljivi na aldikarb, lijek kojim se ispituje neuromišićni prijenos, a metilensko plavilo pomjerilo je odgovor prema normalnom. Broj degenerirajućih nastavaka motornih neurona smanjio se, s najjasnijim učinkom pri 60 μM. Kod riba se plivanje izazvano dodirom znatno poboljšalo, a skraćeni motorni aksoni ponovo su rasli prema normalnoj dužini pri 30 ili 60 μM, iako je oporavak bio djelimičan, a ne potpun.

Podaci o oksidativnom stresu u skladu su s tumačenjem da je djelovanje antioksidativno. Mutirani crvi i ribe pokazivali su povišene vrijednosti pokazatelja reaktivnih oblika kisika, koje su se smanjile uz tretman, a normalni crvi izloženi metilenskom plavilu preživjeli su prooksidativni izazov mnogo duže od netretiranih crva. Ipak, važna su dva ograničenja. Ukupne količine mutiranih proteina TDP-43 i FUS nisu se smanjile, a studija nije direktno kvantificirala proteinske agregate, pa pokazuje funkcionalni oporavak bez dokaza o uklanjanju agregata. Svako ko prati kako se obično formuliraju redoks i mitohondrijske hipoteze treba smatrati da je mehanizam potkrijepljen, ali ne i konačno utvrđen.

Vrijeme početka tretmana bilo je najpoučniji detalj. Kada su autori čekali do 5. dana odraslog stadija da započnu tretman, stopa paralize 12. dana iznosila je oko 55 posto, umjesto oko 10 posto uz tretman od izlijeganja. Isti lijek, isti crv, ista mutacija, mnogo manji učinak. Rana profilaktička izloženost bila je zaslužna za veliki dio uočene koristi.

Nulti rezultat: šta je pokazala studija na miševima sa SOD1

Studija na miševima iz 2011. godine postavila je teže pitanje u strožem sistemu. Kod kongenih miševa sa SOD1 G93A bolest napreduje od tremora stražnjih udova, preko poremećaja hoda i gubitka refleksa ispravljanja, do unaprijed definiranog terminalnog ishoda. Tretman je počeo prije simptoma, 45. dana, i nastavljen je svakodnevno, a posmatrači su ocjenjivali neurološko stanje na skali od 0 do 6. Ovo je eksperiment koji prati cjelokupan tok bolesti, zbog čega je bliži onome što je pacijentu važno nego bilo koja krivulja paralize kod crva.

Glavni rezultati nisu pokazali učinak. Ukupno gledano, početak bolesti nastupio je sa 121 danom u kontrolnoj grupi, naspram 124 dana uz metilensko plavilo, što nije bila značajna razlika. Preživljavanje do završnog stadija iznosilo je 167 dana naspram 170 dana, također bez značajne razlike. Nekoliko sekundarnih analiza išlo je u prilog tretmanu: kod ženki je početak bolesti kasnio oko 7 dana, a tretirane životinje provele su nešto više vremena u blažim stadijima, a manje u teškim. Uz male podgrupe prema spolu i brojna poređenja stadija, te nalaze treba shvatiti kao osnovu za postavljanje hipoteza, a ne kao dokaz. Nisu mjereni broj neurona, agregacija SOD1 niti oksidativni ili upalni markeri, pa studija također ne može pokazati je li lijek dosegao svoje ciljne strukture i nije djelovao ili na njih pri ovoj dozi jednostavno nikada nije djelovao. Testirana je samo jedna doza.

Sami autori istakli su najvažnije ograničenje, koje vrijedi u oba smjera. Model SOD1 G93A s velikim brojem kopija dobro predstavlja bolest izazvanu toksičnim SOD1, ali bolest povezana sa SOD1 čini mali dio porodičnog ALS-a i biološki se razlikuje od većine sporadičnih slučajeva. Predložili su ponovno testiranje kandidata u modelima sisara zasnovanim na TDP-43. Taj prijedlog je u međuvremenu postao složeniji, jer autori studije na crvima i ribama navode da ni zasebna studija metilenskog plavila na miševima s TDP-43 nije poboljšala motoričke ishode. Spoj, dakle, može pokazati snažan učinak u jednom sistemu s TDP-43, a nikakav u drugom sistemu s TDP-43. Sistem je jednako važan kao i gen.

Zašto poboljšanje kod crva ili ribe ne može dokazati korist za pacijente

Posmatrajte svaki model kao odgovor na drugačije pitanje.

Prvo, biologija se razlikuje. TDP-43 i FUS su proteini koji vežu nukleinske kiseline i imaju zajedničke genetske interakcije u ovim jednostavnim sistemima, dok toksičnost SOD1 djeluje kroz djelimično različite neposredne mehanizme. Lijek koji ublažava jedan proteotoksični stres ne mora ublažavati drugi, a uspjeh protiv prekomjerne ekspresije u embriju ne mora predviđati uspjeh protiv spore neurodegeneracije kod odraslih, uz upalu, učešće glijalnih ćelija i pogoršanje stanja cijelog organizma.

Drugo, izloženost se razlikuje. Kontinuirana izloženost u kupki pri mikromolarnim koncentracijama nije isto što i oralna primjena. Apsorpcija u crijevima, metabolizam prvog prolaska, vezivanje za proteine plazme, prodiranje u mozak i klirens nalaze se između progutane doze i motornog neurona u kičmenoj moždini. Nijedna studija nije mjerila koncentracije lijeka u nervnom sistemu, pa nijedna ne može povezati svoju koncentraciju s onom u drugoj studiji.

Treće, vrijeme početka se razlikuje. Koristi kod crva i riba uveliko su zavisile od tretmana prije nego što su se patološke promjene nagomilale. Tretman kod miševa također je počeo prije simptoma, što je prednost, ali liječenje kod ljudi gotovo uvijek bi počelo nakon pojave simptoma, dakle još kasnije. Profilaktički signal u dvodnevnom testu na embrijima polazna je tačka za istraživanje, a ne model kliničke primjene.

Četvrto, ishodi se razlikuju. Paraliza nakon 12 dana, osjetljivost na aldikarb, dužina aksona u mikrometrima i udaljenost preplivana plivanjem predstavljaju neposredne fenotipove. Početak bolesti i preživljavanje kod sisara objedinjuju sve kompenzacijske i otežavajuće procese u tijelu. Lijekovi često mijenjaju neposredne pokazatelje bez promjene preživljavanja, zbog čega postoje ishodi koji mjere vrijeme do događaja kod sisara.

Čitaoci koji žele kontrolnu listu za sljedeći naslov mogu je preuzeti iz članka kako čitati pretkliničke studije: provjerite vrstu, transgen, dozu i put primjene, jesu li mjerene koncentracije lijeka, kada je tretman počeo u odnosu na patološke promjene, je li ishod bio kratkoročni fenotip ili tok bolesti i je li učinak ponovljen u drugoj laboratoriji. U široj bazi dokaza o metilenskom plavilu kod ljudi i dalje treba provjeravati je li neki od ovih ranih signala prerastao u kliničke podatke.

Šta ovo znači za pacijente i porodice

Iz ovih radova ne proizlazi utvrđen protokol primjene metilenskog plavila za ALS. Pozitivna studija podržava daljnja istraživanja oksidativnih i sinaptičkih mehanizama u biologiji TDP-43 i FUS. Studija s nultim rezultatom govori protiv očekivanja da će hronična oralna primjena pri ovoj izloženosti promijeniti tok bolesti tipa SOD1. Zajedno opisuju nedosljednost među modelima, a ne preporuku za liječenje.

Sigurnost zahtijeva jednako odmjeren pristup kao i efikasnost. Studije ALS-a na miševima ne govore ništa o sigurnom doziranju kod ljudi, a metilensko plavilo nosi stvarne rizike od hemolize kod nedostatka G6PD i serotoninske toksičnosti u kombinaciji sa serotonergičkim lijekovima. Sumnja na nedostatak G6PD, trenutna upotreba antidepresiva i svaka planirana promjena lijekova teme su za razgovor s ljekarom, kao i pregled općih podataka o sigurnosti metilenskog plavila prije nego što bilo ko postupi na osnovu naslova o laboratorijskim nalazima.

Suština stane u jednu rečenicu. Metilensko plavilo dovelo je do izraženog poboljšanja fenotipova pri ranoj izloženosti kod crva i ribljih larvi s TDP-43 i FUS, a gotovo nikakve koristi za početak bolesti ili preživljavanje u studiji hronične oralne primjene na miševima sa SOD1, pa je pošteno tumačenje da su dokazi zavisni od modela i da ne podržavaju primjenu kod pacijenata.