Ko je razvio ljubičasto bojenje krvi? Metilensko plavo, Malachowski, Romanowsky i Giemsa

Eozin je crven. Metilensko plavo je plavo. Pomiješajte ih, nanesite mješavinu na osušeni razmaz krvi i dijelovi razmaza postaju ljubičasti.

Ne svi dijelovi. U dobro pripremljenom preparatu jedra bijelih krvnih ćelija poprimaju crvenoljubičastu boju, a unutar parazita malarije hromatin poprima istu boju, dok okolne crvene krvne ćelije ostaju ružičaste, a citoplazma sivoplava. Ljubičasta boja omogućava razlikovanje tipova ćelija.

Nijedna bočica ne sadrži ljubičastu boju. Ona nastaje tek kada određeni produkt razgradnje metilenskog plavog dođe u dodir s eozinom na predmetnom stakalcu, a tokom 1880-ih i 1890-ih niko nije znao da taj produkt postoji, a kamoli šta je. Ljudi koji su pokušavali dobiti tu boju radili su sami, s nečistim bojilima, bez pouzdanog načina da utvrde šta se nalazi u bočici nakon što je dva mjeseca stajala na polici.

Zato pitanje iz naslova ima više od jednog odgovora koji se može potkrijepiti i zato se odgovor promijenio 2011.

Ono što se moglo vidjeti mijenjalo se s mješavinom

Ovo bojenje nije nastalo jednim izumom. Razvijalo se postepeno. Svaka promjena mješavine omogućila je da se vidi tačno jedan novi detalj, a slijed tih detalja najjasnije prikazuje njegovu historiju.

Važan je obrazac u posljednjoj koloni. Svaki napredak proširio je raspon boja, a svako proširenje učinilo je vidljivom još jednu strukturu. Ljubičasta boja nije ukras ove tehnike; ona čini razliku između toga da vidite prisustvo parazita i toga da vidite od čega je građen. Kako je samo bojilo iz BASF-ove fabrike boja dospjelo u medicinu opisuje duža historija s vlastitom dokumentacijom. Cijeli prethodni slijed, s izvorom za svaku stavku, nalazi se u hronologiji doprinosa s poveznicama na izvore.

Slika: istih šest mješavina prikazano kroz ono što je bilo u posudi i ono što se time dobilo. Krugovi predstavljaju bojila; blokovi ispod njih predstavljaju boje koje su ta bojila mogla proizvesti u razmazu krvi. Prije 1890 nema crvenoljubičastog bloka, a poslije te godine nema prikaza bez njega.

Čovjek koji je namjerno koristio boraks

Ernst Malachowski bio je ljekar u Breslauu, današnjem Wrocławu, koji je svoju karijeru proveo u privatnoj praksi i maloj klinici koju je vodio s kolegom, a laboratorijskim radom bavio se u svoje slobodno vrijeme. Rođen je u Strzelnu 12. marta 1857, studirao je medicinu na Univerzitetu u Breslauu i od 1882 do 1887 radio kao asistent na internoj medicini u Bolnici Svih svetih, tada drugoj najvećoj bolnici u Njemačkoj.

Počeo je 1888 s dvostrukim bojenjem Chęcińskog i Plehna. U preparatu napravljenom 1889 primijetio je da se hromatin jedra plazmodija boji drugačije od citoplazme, a zatim je utvrdio da taj rezultat ne može ponoviti. Pokušao je zakiseliti metilensko plavo, što je pogoršalo rezultate. Pokušao ga je alkalizirati boraksom, što je uspijevalo svaki put. Metodu je javno demonstrirao 15. juna 1890, a detaljniji opis objavio je u augustu 1891, uključujući uputu za upotrebu boraksa. Naveo je da bojenje traje dvadeset četiri sata i da su rezultati lako ponovljivi.

Dvadeset četiri sata je dugo u dijagnostičkoj laboratoriji, a njegov rad nije se detaljno bavio ljubičastocrvenom bojom jedra parazita. Bez obzira na razlog, niko nije nastavio s namjernom alkalizacijom metilenskog plavog sve dok Nocht to nije ponovo uradio 1898. Malachowski više nikada nije pisao o bojenju krvi.

Razlog zbog kojeg se o njemu donedavno znalo tako malo leži u arhivskoj građi, a ne u nekoj misteriji. U medicinskoj literaturi gotovo da nije sačuvan trag njegovog života, a ono što je sačuvano stiglo je jednim putem. Njegova kćerka Marie napustila je Njemačku i otišla u London 1939, služila je u britanskoj vojsci i nastanila se u Kanadi, a njena zbirka porodičnih dokumenata završila je u Institutu Leo Baeck u New Yorku. Njen brat Leo poginuo je u Prvom svjetskom ratu. Njena sestra Eva deportovana je iz Breslaua u tranzitni logor Izbica u aprilu 1942 i nikada se nije vratila. Njena majka Hedwig oduzela je sebi život 22. aprila 1942, ne želeći čekati istu deportaciju. Malachowski je umro 1934, prije svih tih događaja.

Porodična historija koja se tako završi prestaje se spominjati u literaturi. Dva rada koja su Malachowskog vratila u historiju razvoja ovog bojenja, oba objavljena 2011, sastavljena su na osnovu arhivskih dokumenata iz Poznańa i Wrocława te dokumenata koje je Marie ostavila u New Yorku.

Bočica s plijesni i Rus koji je imao sreće

Dmitri Romanowsky studirao je medicinu na Vojnomedicinskoj akademiji u Sankt Peterburgu i veći dio karijere bavio se malarijom. Godine 1890 objavio je metodu koja je, prema opisu, bila gotovo identična metodi Chęcińskog: neizmijenjeno metilensko plavo i eozin, uz nešto više eozina.

U septembru 1891 objavio je metodu koja ga je proslavila, a ključni detalj bio je skriven među uputama. Najbolje rezultate dobivao je sa zalihom rastvora metilenskog plavog, rastvorom koji je stajao više od dva mjeseca i na kojem se razvila plijesan. Plijesan i vrijeme stajanja doveli su do djelimične demetilacije bojila. Romanowsky to nije znao i nije mogao kontrolisati taj proces, a drugi istraživači koji su pokušali primijeniti njegovu metodu nisu mogli dobiti ljubičastu boju. Njegova disertacija predana je u Sankt Peterburgu u junu 1891, zbog čega se u uobičajenim prikazima 1891 smatra godinom otkrića.

Malachowski je svoju demonstraciju održao u junu 1890, više od godinu ranije, a njegova metoda davala je željeni rezultat namjerno.

Zašto je naziv dobio ime po pogrešnom čovjeku

Dokaze u prilog Malachowskom prikupili su Kristine Krafts, Ernst Hempelmann i Barbara Oleksyn, a zasnivaju se na četiri činjenice. Datum javne demonstracije, juni 1890 naspram septembra 1891. Riječ namjerno naspram riječi slučajno. Činjenica da je Malachowski objavio svoju metodu, uključujući boraks, dok je Romanowskyjeva zavisila od nekontrolisane varijable. I zapažanje da je opis jedra plazmodija, zajedno s ljubičastom bojom koja ga je učinila vidljivim, praktično nestao iz literature na sedam godina jer niko nije mogao ponoviti slučajno uspjelu verziju.

Njihov zaključak je direktan. U biografskom radu tu dodjelu zasluga nazivaju „izrugivanjem istini“ i citiraju Ralpha Lillieja, koji je 1978 napisao da „bismo ovu porodicu bojenja možda trebali nazivati Malachowskijevim bojenjima“.

Ta tvrdnja je osporavana, kao što tvrdnje o prvenstvu obično i jesu, a prirodu tog spora vrijedi objasniti umjesto presuditi. Rasprava o prvenstvu mora definisati šta je bilo otkriće. Ako je otkriće ljubičasta boja, Malachowski ima raniju dokumentovanu demonstraciju. Ako je otkriće objavljena metoda, obojica su je objavila 1891, a naziv je dobio ime po Romanowskom. Ako je otkriće objašnjenje, nijedan nema pravo na prvenstvo jer nijedan nije znao da je sazrijevanje zapravo demetilacija i nijedan nije mogao reći zašto se boja uopće pojavljuje. Upravo tu posljednju činjenicu popularni prikazi preskaču. Aktivni sastojak bio je nečistoća koju niko nije identifikovao, a prvi čovjek koji je namjerno proizveo tu boju učinio je to na osnovu ponovljivog empirijskog recepta, bez razumijevanja onoga što taj recept radi.

Dva rada iz 2011 predstavljaju najpotpuniji objavljeni prikaz dokaza u prilog Malachowskom, a oba su dostupna za besplatno čitanje putem PubMeda: opsežni pregled na PMID 21235291 i biografski rad na PMID 21660627. PubMedov zapis za pregledni rad navodi i komentar na njega, objavljen u istom časopisu kasnije te godine na 86(5):366, što podsjeća da su ti argumenti bili osporavani u štampi čim su se pojavili.

Ovaj spor ne proizlazi iz neslaganja o hemiji. Svi učesnici slažu se oko toga šta je ljubičasta boja i koje je komponente proizvode. Neslaganje se tiče toga ko je prvi došao do nje i toga može li se slučajan rezultat koji niko nije mogao ponoviti uopće smatrati postignućem.

Šta su omogućili kasniji istraživači

Ako je Malachowski prvi proizveo ljubičastu boju, zašto bojenje nosi imena Romanowskog, Wrighta i Giemse?

Zato što mješavina za bojenje koja jednom uspije u rukama svog izumitelja još nije reagens. Kasniji rad pretvorio je nepredvidivu mješavinu u nešto što je laboratorijski tehničar u drugoj zemlji mogao upotrijebiti bilo kojeg utorka.

Nocht je do rješenja došao zaključivanjem. Nakon što jednostavnim neutralnim bojilom nije uspio dobiti pouzdan rezultat, zaključio je da ljubičasta boja mora poticati od nečega u metilenskom plavom što samo nije metilensko plavo i počeo je tražiti tu komponentu. Unna je već primijetio da stari rastvori metilenskog plavog boje granule mastocita crveno i pretpostavio da se tokom sazrijevanja bojila stvara nova supstanca. Bernthsen je 1885 pokazao da alkalni uslovi uklanjaju metilne grupe iz metilenskog plavog i da su ti produkti ono što danas nazivamo azurima. Nocht je hloroformom ekstrahirao aktivnu frakciju i mogao ju je nazvati samo crveno iz metilenskog plavog; Michaelis ju je 1901 nazvao azur I. Jenner je riješio praktične poteškoće. Ponovnim rastvaranjem taloga metilenskog plavog i eozina u apsolutnom metanolu dobiven je jedinstven, stabilan rastvor koji je fiksirao razmaz tokom bojenja i uklonio potrebu za fiksacijom toplotom. Leishman i Reuter kombinovali su polihromirano bojilo s alkoholnim rastvaračem i istovremeno dobili stabilnost i ljubičastu boju. Wright je dvanaestosatnu inkubaciju na 65 °C i deset dana stajanja zamijenio jednim satom izlaganja struji vodene pare. Giemsa se potpuno prestao oslanjati na nasumično sazreli rastvor, koristeći odmjerene količine poznatih bojila uz dodatak glicerola u metanol kako bi proizvod podnio tropsku vrućinu. Nikada nije objavio kako je pravio čisti metilenski azur. Prodavao ga je laboratoriji dr. Grüblera u Leipzigu, koja ga je nudila kao azur I i tvrdila da je samo njena verzija autentična Giemsina boja.

O identitetu tog azura još se raspravlja. Neki smatraju da je to jednostavno bilo polihromirano metilensko plavo, a drugi da je sadržavalo visok udio Azure B. Odgovor je proizašao iz rata. Kada njemačka bojila više nisu bila dostupna, tim Službe za javno zdravstvo Sjedinjenih Američkih Država, Ralph Lillie s Mauriceom Roeom i Aimee Wilcox, utvrdio je da se najbolje bojenje postiže pomoću tri razdvojene komponente: neizmijenjenog metilenskog plavog, njegovog demetiliranog produkta razgradnje Azure B i eozina. Azure B zamijenio je nedostupni azur I, a te tri komponente i danas su osnova bojenja koje se koristi za dijagnosticiranje malarije.

Hemija međudjelovanja tih triju komponenti na predmetnom stakalcu zasebno je pitanje i tema druge stranice. Stranica o ulogama bojila i hemiji bojenja tipa Romanowsky objašnjava šta rade Azure B i eozin pojedinačno i zašto zajedno proizvode boju koju nijedan ne proizvodi sam. Stranica o primjeni u mikroskopiji i laboratoriji obrađuje praktičnu stranu: šta određeni preparat prikazuje i kako procijeniti je li konkretan proizvod prikladan za metodu koju namjeravate koristiti.

Dio historije koji je i dalje aktuelan

Jedna činjenica iz ove priče nije prestala važiti 1902. Otprilike pedeset godina najvažnija komponenta standardnog bojenja za malariju u svijetu bila je neimenovana nečistoća. Bila je prisutna slučajno, njena količina razlikovala se od bočice do bočice, njen identitet dio tog vremena bio je poslovna tajna, a o njenom udjelu raspravljalo se sve do 1940-ih. Ljudi koji su koristili to bojenje nisu bili nemarni. Nisu imali način da saznaju šta se nalazi u bočici.

Savremena verzija istog problema jeste specifikacija koja opisuje samo dio materijala. Usklađenost s USP-om put je do najviše čistoće koju tržište nudi, jer je riječ o cjelovitom objavljenom standardu, a ne o jednom mjerenju: identitet, čistoća, organske nečistoće uključujući azurna bojila, rezidualni rastvarači, elementarne nečistoće, ostatak nakon žarenja, mikrobiološke granice i bakterijski endotoksini. Blupreme nabavlja svoje metilensko plavo od farmaceutskog proizvođača i objavljuje puni certifikat analize kako bi se svaka stavka s tog spiska mogla provjeriti umjesto samo navesti kao tvrdnja. Certifikat koji navodi rezultat ispitivanja na teške metale i to naziva usklađenošću s USP-om današnji je ekvivalent bočice s oznakom „sazrelo metilensko plavo“: možda je riječ o dobrom reagensu, ali oznaka vam ne govori šta je u njemu.