নিউ মিথিলিন ব্লু ও রেটিকুলোসাইট স্টেইনিং: একটি পৃথক রঞ্জক ও জীবিত-কোষ পদ্ধতি

একজন শিক্ষার্থী রেটিকুলোসাইট গণনার প্রস্তুতি নেয়, মিথিলিন ব্লু অর্ডার করে, সেটি রক্তের সঙ্গে মেশায় এবং প্রায় কিছুই দেখতে পায় না। এক সহপাঠী new methylene blue লেখা একটি বোতল ব্যবহার করে এবং লোহিত কণিকার একটি অংশের ভেতরে স্পষ্ট নীল ফিলামেন্ট দেখতে পায়। প্রথম শিক্ষার্থী ধরে নেয়, দ্বিতীয় বোতলের দ্রবণটি বেশি তাজা বা বেশি ঘন। বাস্তবে কোনোটিই নয়। এতে একটি ভিন্ন অণু রয়েছে।

এই ক্ষেত্রের বেশিরভাগ বিভ্রান্তির পেছনে এটাই মূল ধারণাগত ভুল। নামটি দেখে মনে হতে পারে, নিউ মিথিলিন ব্লু হলো মিথিলিন ব্লুর উন্নত কোনো ব্যাচ। কিন্তু রসায়ন তা বলে না। নিউ মিথিলিন ব্লু N একটি পৃথক phenothiazine রঞ্জক, যার নিজস্ব Colour Index নম্বর, নিজস্ব substitution pattern এবং hematology-তে নিজস্ব মানসম্মত ভূমিকা রয়েছে। এই পার্থক্যটি পরিষ্কার হয়ে গেলে পদ্ধতির বাকি অংশও সহজ হয়ে যায়—স্টেইন করার সময় কোষগুলো কেন জীবিত থাকতে হবে, কোন কোষকে রেটিকুলোসাইট হিসেবে গণনা করা হবে, Heinz bodies কোথায় প্রাসঙ্গিক এবং brilliant cresyl blue কখন ব্যবহৃত হয়।

সংক্ষিপ্ত উত্তর

Hematology reagent হিসেবে ব্যবহৃত নিউ মিথিলিন ব্লু N সাধারণত নিউ মিথিলিন ব্লুর PubChem রেকর্ডে Basic Blue 24 হিসেবে চিহ্নিত, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, formula C18H22ClN3S। সাধারণ মিথিলিন ব্লু হলো এর PubChem রেকর্ডে methylthioninium chloride, Basic Blue 9, C.I. 52015, CAS 61-73-4, formula C16H18ClN3S। গঠনগতভাবে, নিউ মিথিলিন ব্লুতে দুটি ring methyl group এবং ethylamino side chain থাকে, যেখানে মিথিলিন ব্লুতে dimethylamino group থাকে। এই পার্থক্য স্টেইনিংয়ের আচরণ বদলে দেয়। Hematology-র পাঠ্যসূত্রগুলো সাধারণ মিথিলিন ব্লুকে তুলনামূলকভাবে দুর্বল রেটিকুলোসাইট stain এবং নিউ মিথিলিন ব্লুকে আরও গভীর ও সমান stain হিসেবে বর্ণনা করে; এই তুলনাটি নিউ মিথিলিন ব্লু সম্পর্কিত ScienceDirect topic-এ সংক্ষেপে দেওয়া হয়েছে।

হ্যাঁ, নিউ মিথিলিন ব্লু একটি supravital stain। Supravital staining বলতে শরীর থেকে অপসারণের পর এবং fixation-এর আগে জীবিত কোষকে stain করা বোঝায়, যেমনটি supravital staining-এর নীতিমালা নিয়ে NCBI review-তে সংজ্ঞায়িত হয়েছে। নিউ মিথিলিন ব্লু এবং brilliant cresyl blue—দুটিই এই শ্রেণির অন্তর্ভুক্ত, এবং CLSI reticulocyte standard-এ নিউ মিথিলিন ব্লুকে স্পষ্টভাবে supravital dye হিসেবে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছে। শিক্ষার্থীরা কখনও কখনও এটিকে fixed film-এর Romanowsky staining-এর সঙ্গে একই শ্রেণিতে ফেলে। এখানে সেই ধারণা কাজ করে না। আগে fix করলে পদ্ধতিটি আর কাজ করে না।

কাছাকাছি নামের রঞ্জকগুলো অনুসরণ করতে চাইলে, methyl blue বনাম methylene blue একটি anionic triarylmethane dye এবং cationic phenothiazine family-র মধ্যকার ভিন্ন ও আরও বড় বিভ্রান্তি ব্যাখ্যা করে। laboratory staining-এর সারসংক্ষেপ fixed-film method-গুলোর পাশাপাশি supravital কাজের অবস্থান দেখায়, আর blood cell morphology guide বিস্তৃত differential-এর মধ্যে reticulocyte assessment কোথায় ব্যবহৃত হয় তা দেখায়।

Catalog-সংক্রান্ত একটি সতর্কতা: নিউ মিথিলিন ব্লুর পৃথক zinc chloride double-salt form CAS 6586-05-6-এর অধীনে বিদ্যমান। তাই methods section-এ শুধু প্রচলিত নাম নয়, salt form এবং supplier-ও উল্লেখ করা উচিত।

Supravital staining আসলে কী করে

রেটিকুলোসাইট হলো একটি তরুণ লোহিত কণিকা, যা nucleus হারিয়েছে কিন্তু কিছু residual ribosomal RNA ধরে রেখেছে। Stain না করা wet preparation-এ এই RNA দৃশ্যমান নয়। Supravital dye জীবিত কোষে প্রবেশ করে এবং ওই RNA-কে নীল granule ও filament হিসেবে precipitate বা aggregate করে; oil immersion-এ এগুলোই reticulofilamentous material হিসেবে দেখা যায়। তাই এই network আগে থেকেই তৈরি কোনো skeleton নয়, যা শুধু রং ধরার অপেক্ষায় ছিল; এটি staining-এর ফলে তৈরি হয়। এজন্য protocol-এর variable—dye concentration, buffer, blood to dye ratio, temperature, time—রঞ্জকের নামের মতোই গুরুত্বপূর্ণ।

ব্যবহারিকভাবে এর অর্থ হলো কাজের ধাপের একটি কঠোর ক্রম: প্রথমে anticoagulated blood-এর সঙ্গে dye মেশান, incubate করুন, তারপর film তৈরি করুন এবং fixation বা counterstain ছাড়াই পরীক্ষা করুন। Staining-এর আগে fixation করা, অথবা হালকা filament আড়াল করে এমন counterstain ব্যবহার করা, গণনার জন্য প্রয়োজনীয় তথ্য নষ্ট করে দেয়।

নিউ মিথিলিন ব্লু দিয়ে কার্যকর রেটিকুলোসাইট প্রোটোকল

একটি সর্বজনীন formulation নেই, তাই যেটি ব্যবহার করা হয়েছে সেটিই report করা উচিত। নথিভুক্ত তিনটি variant এই পরিসরটি দেখায়।

Classic Brecher type procedure-এ প্রায় 0.5 percent নিউ মিথিলিন ব্লু potassium oxalate-এর সঙ্গে ব্যবহার করা হয়, ভালোভাবে মেশানো EDTA blood-এর সমান volume-এর সঙ্গে মেশানো হয় এবং room temperature-এ প্রায় 10 to 15 minutes incubate করা হয়। আলতোভাবে আবার মেশানোর পর thin wedge film প্রস্তুত করা হয়, air dried করা হয় এবং fixation ছাড়াই 100x oil objective-এর নিচে পরীক্ষা করা হয়। রেটিকুলোসাইট গণনার NCBI procedure এই workflow এবং এর সঙ্গে ব্যবহৃত counting frame বর্ণনা করে।

Dacie and Lewis variant-এ citrate saline-এ 1.0 percent নিউ মিথিলিন ব্লু ব্যবহার করা হয়, 2 to 4 volumes রক্তের সঙ্গে মেশানো হয় এবং film তৈরির আগে 37 C তাপমাত্রায় 15 to 20 minutes রাখা হয়। CLSI H44 procedure-এর একটি সাম্প্রতিক harmonization implementation-এ pH 7.4 phosphate buffered saline-এ আরও dilute 0.1 percent solution ব্যবহার করা হয়েছিল, যেখানে 20 C তাপমাত্রায় 10 minutes incubation করা হয় এবং fixation করা হয়নি, যেমনটি 2026 NMB harmonization study-তে report করা হয়েছে।

সব variant-এ counting rule একই। কোনো কোষে অন্তত দুটি পৃথক নীল staining granule বা filament segment থাকলে সেটিকে reticulocyte হিসেবে score করুন; এতে বিচ্ছিন্ন stain deposit বাদ পড়ে। Routine work-এ অন্তত 1,000 লোহিত কণিকা গণনা করুন এবং reticulocyte-কে percentage হিসেবে report করুন। Percentage কম হলে পরিসংখ্যানগতভাবে আরও বেশি কোষ গণনা করতে হয়। CLSI H44 methodology-এর একটি review-তে উল্লেখ করা হয়েছে যে প্রায় 1 percent reticulocytes-এর ক্ষেত্রে counting variation 5 percent-এ নামিয়ে আনতে প্রায় 4,400 cells প্রয়োজন, যেমনটি De Gruyter-এর CLSI H44 review-তে বলা হয়েছে। Miller ocular disc বড় সংখ্যার গণনাকে ব্যবহারিক করে তোলে। Dye filter করুন বা নতুন করে প্রস্তুত করুন, কারণ precipitate granular inclusion-এর মতো দেখাতে পারে।

একই preparation-এ Heinz bodies

একই supravital film-এ Heinz bodies-ও দেখা যায়, যা residual RNA নয়; এগুলো oxidized এবং denatured hemoglobin-এর aggregate। নিউ মিথিলিন ব্লু preparation-এ এগুলো গোলাকার body হিসেবে দেখা যায়, প্রায়ই একটি করে এবং membrane-এর কাছে থাকে, এবং reticulofilamentous material-এর তুলনায় হালকা নীল stain ধরে। Fixation ও counterstaining-এর পর এগুলো ভালোভাবে টিকে থাকে না, তাই unfixed film পরীক্ষা করুন। সাম্প্রতিক একটি protocol-এ 20 microliters EDTA blood-এর সঙ্গে 20 microliters 1 percent নিউ মিথিলিন ব্লু এবং 15 minutes incubation ব্যবহার করে 250 erythrocytes-এর মধ্যে Heinz body positive cell পরিমাপ করা হয়েছে, যেমনটি ওই procedure report করা PMC study-তে বলা হয়েছে।

দুটি পার্থক্য ভুল ব্যাখ্যা এড়াতে সাহায্য করে। প্রথমত, methyl violet এবং crystal violet নিউ মিথিলিন ব্লুর তুলনায় Heinz bodies-কে আরও তীব্রভাবে stain করে, যেমনটি ScienceDirect-এর Heinz body topic-এ উল্লেখ করা হয়েছে। Reticulocyte এবং Heinz bodies একসঙ্গে assessment করার সময় নিউ মিথিলিন ব্লু সুবিধাজনক পছন্দ, তবে এটি Heinz body-এর জন্য সবচেয়ে শক্তিশালী dedicated dye নয়। দ্বিতীয়ত, alpha thalassemia trait-এ HbH inclusion supravital staining-এর পর পুরো কোষজুড়ে অসংখ্য সূক্ষ্ম dot তৈরি করে, যেখানে classic Heinz bodies সংখ্যায় কম, আকারে বড় এবং প্রায়ই membrane-associated। Stain deposit তৃতীয় mimic: এটি কোষের focal plane-এর বাইরে থাকে এবং field ভেদে পরিবর্তিত হয়।

Brilliant cresyl blue বনাম নিউ মিথিলিন ব্লু

দুটি dye-ই reticulocyte-এর supravital stain, তবে standardization-এর ক্ষেত্রে একটিকে বেশি অগ্রাধিকার দেওয়া হয়। International Council for Standardization in Haematology-এর সঙ্গে যৌথভাবে তৈরি CLSI H44-A2 reticulocyte method, যা CLSI H44 standard page-এ তালিকাভুক্ত, EDTA blood-এর নিউ মিথিলিন ব্লু staining-কে manual comparative method হিসেবে নির্ধারণ করে। Classical hematology teaching-ও appearance নিয়ে একই কথা বলে: নিউ মিথিলিন ব্লু আরও গভীর এবং সমান filament staining দেয়, যেখানে brilliant cresyl blue batch এবং sample ভেদে বেশি পরিবর্তিত হয়।

তবে এই অবস্থানের একটি qualifier রয়েছে। ICSH analyzer evaluation guideline manual নিউ মিথিলিন ব্লু microscopy-কে reference comparison approach হিসেবে গ্রহণ করে, কিন্তু এটিকে subjective এবং তুলনামূলকভাবে imprecise বলে; যেখানে সুবিধা আছে সেখানে flow cytometric reference procedure-কে অগ্রাধিকার দেওয়া হয়। 100 specimens নিয়ে 2022 সালের একটি comparison-এ analyzer-এর তুলনায় নিউ মিথিলিন ব্লুর চেয়ে brilliant cresyl blue-এ কম bias পাওয়া গিয়েছিল, যেমনটি staining method-এর PMC comparison-এ report করা হয়েছে। শিক্ষার্থীদের জন্য সমর্থনযোগ্য সারসংক্ষেপ হলো: standardized manual comparator হিসেবে নিউ মিথিলিন ব্লু ব্যবহার করুন, যেকোনো local brilliant cresyl blue method-কে এর বিপরীতে বা automation-এর বিপরীতে verify করুন, এবং যেকোনো ক্ষেত্রেই manual microscopy থেকে বেশি scatter আশা করুন। পুরোনো standardization literature-এ purified Azure B-কে রাসায়নিকভাবে আরও পরিষ্কার বিকল্প হিসেবেও সমর্থন করা হয়েছিল, কারণ commercial dye lot ভেদে পরিবর্তন হতো, যেমনটি Azure B নিয়ে Marshall study-তে দেখানো হয়েছে; এ কারণেই methods discussion-এ reagent grade এখনও দেখা যায়।

প্রচলিত ভুল এড়ানো

বেশিরভাগ ব্যর্থ preparation-এর পেছনে চারটি ভুল থাকে। নিউ মিথিলিন ব্লু N-এর বদলে সাধারণ মিথিলিন ব্লু অর্ডার করলে chemistry-র কারণে staining দুর্বল হয়, technique-এর কারণে নয়। Reading-এর আগে fixation বা counterstaining করলে supravital signal হারিয়ে যায়। Stain precipitate-কে granule হিসেবে গণনা করলে ফল কৃত্রিমভাবে বেড়ে যায়; two granule rule এবং filtered dye এটি প্রতিরোধ করে। Reticulocyte percentage কম থাকা অবস্থায় খুব কম কোষ গণনা করলে দেখতে নির্ভুল একটি সংখ্যা পাওয়া যায়, কিন্তু তার confidence limit প্রশস্ত থাকে। প্রতিটি ভুলের একই বৈশিষ্ট্য: microscopist microscope-কে দোষ দেয়, অথচ ফল নির্ধারণ করে দিয়েছিল reagent step। :::