মিথিলিন ব্লু দিয়ে গালের কোষ রঞ্জন: কী পর্যবেক্ষণ করবেন

একজন শিক্ষার্থী একটি স্লাইডে গালের কোষের সাসপেনশনের এক ফোঁটা রাখে, মাইক্রোস্কোপের নিচে তাকায় এবং প্রায় কিছুই দেখতে পায় না। উজ্জ্বল ক্ষেত্রে কয়েকটি ফ্যাকাশে ছায়ার মতো বস্তু ভেসে যায়। সে ফোকাস ঠিক করে, তারপর আরও আলো দেয়, তারপর সিদ্ধান্তে আসে যে স্লাইডটি খালি। স্লাইডটি খালি নয়। কোষগুলো সেখানে আছে। এগুলো প্রায় স্বচ্ছ, এবং এই স্বচ্ছতাই হলো সেই সমস্যা যা সমাধান করার জন্য এই রঞ্জক তৈরি করা হয়েছে।

প্রোটোকল শুরু করার আগে প্রত্যাশা এবং ছবির মধ্যে এই অসামঞ্জস্যের নাম দেওয়া দরকার। নতুন শিক্ষার্থীরা আশা করে যে মাইক্রোস্কোপ এমন বিস্তারিত দেখাবে যেভাবে ক্যামেরার জুম দূরের সাইনবোর্ডকে বড় করে দেখায়। উজ্জ্বল ক্ষেত্রের মাইক্রোস্কোপ একটি সীমিত কাজ করে: এটি আলোর শোষণের পার্থক্য দেখায়। অপরিষ্কার গালের কোষ প্রায় কোনো আলো শোষণ করে না, তাই এটি প্রায় কোনো পার্থক্য তৈরি করে না। মিথিলিন ব্লু সেই পার্থক্য যোগ করে। এটি কোষের ভেতরে আবদ্ধ হয়, অসমভাবে, এবং গঠনতন্ত্রকে কনট্রাস্টে পরিণত করে। শিক্ষার্থীরা একবার এই ধারণাটি বুঝলে, পরবর্তী প্রতিটি ধাপ একটি রেসিপির পরিবর্তে ফলাফল হিসেবে বোঝা যায়।

স্কুলের ল্যাবে সাধারণ রঞ্জন কীভাবে কনট্রাস্ট যোগ করে তার পটভূমি এখানে সহায়ক, এবং রঞ্জনের আগে উজ্জ্বল ক্ষেত্রের মাইক্রোস্কোপ সেট আপ করার পুনরালোচনা অর্ধেক ব্যর্থ স্লাইড প্রতিরোধ করে। রঙের পেছনের রসায়ন মাইক্রোস্কোপিতে মিথিলিন ব্লুর পরিচিতি-এর অন্তর্ভুক্ত, যেখানে ব্যাখ্যা করা হয়েছে কেন এই নির্দিষ্ট রঞ্জকটি বারবার বেঞ্চে দেখা যায়।

শ্রেণিকক্ষের প্রোটোকল

নিচের ওয়েট মাউন্ট সংস্করণটি সাধারণ শ্রেণির জন্য সহজ ডিফল্ট পদ্ধতি। এতে কোনো শিখা এবং কোনো ফিক্সেশন ধাপের প্রয়োজন নেই। কিছু কলেজ ম্যানুয়ালে ব্যবহৃত ফিক্সড স্মিয়ার ভেরিয়েন্টে বায়ু শুকানো এবং সংক্ষিপ্ত তাপ ফিক্সেশন যোগ করা হয়, যেমন North Central Texas College cheek smear activity published through Biology LibreTexts-তে রয়েছে, কিন্তু তাপ ফিক্সেশন হলো মাইক্রোবায়োলজির অভ্যাস, এপিথেলিয়াল কোষ দেখার জন্য এটি প্রয়োজনীয় নয়।

যা প্রয়োজন: পরিষ্কার স্লাইড এবং কভারস্লিপ, জীবাণুমুক্ত একবার ব্যবহারযোগ্য সোয়াব (পছন্দনীয়) অথবা নতুন সমতল টুথপিক, 0.5 থেকে 1 শতাংশ জলীয় মিথিলিন ব্লুর ড্রপার বোতল, পাতিত বা ডি-আয়োনাইজড জল, ব্লটিং পেপার, গ্লাভস এবং 100x ও 400x মোট বিবর্ধনসহ একটি কম্পাউন্ড মাইক্রোস্কোপ।

1. সাধারণ জল দিয়ে মুখ ধুয়ে নিন। এটি খাদ্যের কণা সরিয়ে দেয় যা পরে তীব্রভাবে রঞ্জিত হয়ে কোষ থেকে মনোযোগ সরিয়ে নেয়।
2. প্রতিটি শিক্ষার্থী শুধুমাত্র নিজের গাল থেকে নমুনা নেয়। গালের ভেতরের অংশ একটি নতুন জীবাণুমুক্ত সোয়াব দিয়ে আলতোভাবে ঘষুন। চাপ দিন, আঁচড়াবেন না। অস্বস্তি বা রক্তপাতের অনেক আগেই থামুন।
3. একটি পরিষ্কার স্লাইডের মাঝখানে সোয়াবটি পাতলা করে ঘুরিয়ে নিন। পাতলা ফিল্ম একটি পাঠযোগ্য স্লাইডের সবচেয়ে বড় পূর্বাভাসকারী। একটি পুরু সাদা জমা রঞ্জিত হয়ে অপাঠ্য নীল ভরে পরিণত হবে।
4. স্মিয়ারের ওপর এক ফোঁটা মিথিলিন ব্লু যোগ করুন। 1 থেকে 3 মিনিট রেখে দিন। অনেক কলেজ প্রোটোকলে এক মিনিট যথেষ্ট; NCERT Class IX science laboratory manual-এ অস্থায়ী মাউন্টের জন্য প্রায় 3 মিনিট ব্যবহৃত হয়। বেশি সময় মানেই ভালো নয়, এবং অতিরিক্ত রঞ্জন সবচেয়ে সাধারণ সময়জনিত ভুল।
5. স্থানীয় প্রোটোকল অনুসরণ করে পাতিত জল দিয়ে আলতোভাবে ধুয়ে নিন অথবা ব্লটিং পেপার দিয়ে অতিরিক্ত রঞ্জক শুষে নিন। পটভূমি হালকা নীল হওয়া উচিত, গাঢ় নেভি নয়।
6. একটি প্রান্ত প্রথমে স্পর্শ করিয়ে কভারস্লিপটি কোণে নামিয়ে দিন, তারপর ধীরে ধীরে পড়তে দিন। এতে বায়ুর বুদবুদ এড়ানো যায়।
7. কোষ খুঁজে পেতে কম পাওয়ার দিয়ে শুরু করুন, ফোকাস ও কেন্দ্র নিশ্চিত করুন, তারপর 100x এবং শেষে 400x-এ যান। 400x-এ শুধুমাত্র সূক্ষ্ম ফোকাস ব্যবহার করুন।

রঞ্জকের ঘনত্ব সম্পর্কে একটি নির্ভুল বাক্য প্রয়োজন। স্কুল প্রোটোকলগুলো সাধারণত 1 শতাংশ জলীয় মিথিলিন ব্লুর কাছাকাছি থাকে। শক্তিশালী স্টক বা দীর্ঘ সময়ের এক্সপোজার নিউক্লিয়াসের চেয়ে দ্রুত পটভূমি গাঢ় করে, যা অনুশীলনের প্রয়োজনীয় কনট্রাস্টকে উল্টে দেয়।

গালের উপাদান নিরাপদে পরিচালনা করা

গালের নমুনা লালা এবং স্বাভাবিক মৌখিক অণুজীব নিয়ে আসে, তাই স্বাস্থ্যবান সহপাঠী হলেও প্রতিটি তাজা স্মিয়ারকে সম্ভাব্য সংক্রামক উপাদান হিসেবে বিবেচনা করুন। American Society for Microbiology biosafety guidelines for teaching laboratories সাধারণ নীতিগুলো উল্লেখ করে: সেশনের আগে ঝুঁকি মূল্যায়ন করা, গ্লাভস পরা, ছিটকে পড়ার সম্ভাবনা থাকলে চোখ সুরক্ষিত রাখা, পরে হাত ধোয়া, বেঞ্চ জীবাণুমুক্ত করা এবং অনুমোদিত জৈব বর্জ্য পদ্ধতির মাধ্যমে দূষিত একবার ব্যবহারযোগ্য উপাদান ফেলা।

চারটি শ্রেণিকক্ষ নিয়ম অধিকাংশ ঝুঁকি নিয়ন্ত্রণ করে। একটি সোয়াব এবং একটি স্লাইড শুধুমাত্র একজন দাতার জন্য, কখনো ভাগ নয়। শুধুমাত্র নিজের নমুনা নেওয়া, প্রতিবেশীর নয়। একবার ব্যবহারযোগ্য সোয়াব এবং টুথপিক সরাসরি নির্ধারিত বর্জ্য পাত্রে ফেলুন, কখনো বেঞ্চে ফিরিয়ে রাখবেন না। মিথিলিন ব্লু ত্বক ও কাপড়ে দাগ দেয় এবং চোখে জ্বালা সৃষ্টি করে, তাই গ্লাভস এবং স্বাভাবিক রঞ্জক নিরাপত্তা প্রযোজ্য। স্মিয়ার থেকে কোনো কিছু কালচার করার জন্য এই অনুশীলন বাড়াবেন না এবং স্কুলের নিরাপত্তা পদ্ধতির বাইরে তাজা মানব উপাদানে তাপ ফিক্সেশন করার চেষ্টা করবেন না।

কী পর্যবেক্ষণ করবেন, এবং কেন এমন দেখায়

100x-এ প্রশস্ত সমতল কোষ, ফ্যাকাশে নীল রঙ, অনিয়মিত ডিম্বাকার বা বহুভুজ আকৃতির সীমানা খুঁজুন। এগুলো এককভাবে বা আলগাভাবে ওভারল্যাপ করা স্তরে থাকে। প্রতিটি কোষে সাধারণত একটি গাঢ় নীল দাগ থাকে। সেই দাগটি হলো নিউক্লিয়াস। বিন্যাসটিও লক্ষ্য করুন: স্কোয়ামাস এপিথেলিয়াল কোষ পাতলা টাইলের মতো, গোলক নয়, তাই তাদের প্রান্ত গোল বেলুনের পরিবর্তে ফাটা গ্লেজের মতো দেখায়।

400x-এ তিনটি বৈশিষ্ট্য স্পষ্ট হয়। কোষের সীমানা কোষকে ঘিরে থাকা একটি পাতলা গাঢ় রেখা হিসেবে দেখা যায়। সাইটোপ্লাজম ভেতরের অংশকে হালকা সমান নীল রঙে পূর্ণ করে। নিউক্লিয়াস আরও গাঢ় এবং ঘন, প্রায়ই ডিম্বাকার, সাধারণত কেন্দ্রের কাছে কিন্তু সবসময় নয়। শিক্ষার্থীদের তিনটি বৈশিষ্ট্যসহ আকৃতি এবং বিবর্ধন নথিভুক্ত করতে বলুন, কারণ ওয়ার্কশিটে ঠিক এগুলোই চাওয়া হয়েছে।

এখানে একটি নির্ভুলতার বিষয় গুরুত্বপূর্ণ এবং অনেক ওয়ার্কশিটে এটি ভুল থাকে। দৃশ্যমান সীমানাটি প্লাজমা মেমব্রেনের অঞ্চলের সঙ্গে সম্পর্কিত, কিন্তু মেমব্রেন নিজে, একটি প্রায় 7 থেকে 10 ন্যানোমিটার পুরু লিপিড বিলেয়ার, স্কুলের মাইক্রোস্কোপে সমাধান করা যায় না। শিক্ষার্থীরা যা দেখে তা হলো কোষের অপটিক্যাল প্রান্ত এবং সেখানে জমা হওয়া রঞ্জক। একই সতর্কতা অঙ্গাণুর ক্ষেত্রেও প্রযোজ্য। মাইটোকন্ড্রিয়া, এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলাম, গলজি বডি এবং রাইবোসোম এই প্রস্তুতিতে দেখা যায় না। ভালো পরিস্থিতিতে একটি প্রচলিত আলো মাইক্রোস্কোপ প্রায় 0.2 মাইক্রোমিটার পর্যন্ত সমাধান করতে পারে, যেমন NCBI cell biology background on microscopy tools ব্যাখ্যা করে, এবং অধিকাংশ আল্ট্রাস্ট্রাকচার এই সীমার নিচে বা কাছাকাছি থাকে। বেশি খালি বিবর্ধন ছবিকে বড় করে, কিন্তু অতিরিক্ত বিস্তারিত যোগ করে না।

কেন নিউক্লিয়াস সবচেয়ে গাঢ় রঞ্জিত হয়? মিথিলিন ব্লু একটি ক্যাটায়নিক রঞ্জক, দ্রবণে ধনাত্মক চার্জযুক্ত, এবং এটি কোষের ঋণাত্মক চার্জযুক্ত উপাদানের সঙ্গে যুক্ত হয়, বিশেষত নিউক্লিক অ্যাসিডের সঙ্গে। ক্রোমাটিন নিউক্লিয়াসে DNA ঘনীভূত করে, তাই নিউক্লিয়াস সবচেয়ে বেশি রঞ্জক সংগ্রহ করে। সাইটোপ্লাজমে RNA এবং অন্যান্য চার্জযুক্ত অণু থাকে, তাই এটিও রঞ্জিত হয়, তবে আরও বিস্তৃতভাবে এবং হালকা। গুরুত্বপূর্ণ শর্ত: মিথিলিন ব্লু DNA-নির্দিষ্ট রঞ্জক নয়। methylene blue distribution in nuclear imaging-এর কাজ নিউক্লিক অ্যাসিড সমৃদ্ধ অঞ্চলের সঙ্গে ক্যাটায়নের সম্পর্ক বর্ণনা করে, এবং methylene blue binding in cell preparations-এর পুরোনো পরিমাণগত গবেষণায় দেখা গেছে যে অধিকাংশ আবদ্ধ রঞ্জক নিউক্লিক অ্যাসিডের সঙ্গে সম্পর্কিত। গাঢ় নিউক্লিয়াস এবং হালকা সাইটোপ্লাজম তাই একটি কনট্রাস্ট প্যাটার্ন, কোনো আণবিক পরীক্ষা নয়।

শিক্ষার্থীরা যে ভুল করবে, এবং কীভাবে তা পড়তে হবে

প্রায় প্রতিটি ব্যর্থ স্লাইড পাঁচটি প্যাটার্নের একটিতে পড়ে। শিক্ষার্থীদের অন্ধভাবে পুনরাবৃত্তি না করে স্লাইড নির্ণয় করতে শেখান।

অতিরিক্ত রঞ্জন কোষ এবং পটভূমিকে সমানভাবে গাঢ় করে দেয়, ফলে নিউক্লিয়াস ক্ষেত্রের মধ্যে হারিয়ে যায়। কম সময় রঞ্জিত করুন বা আরও ভালোভাবে ধুয়ে নিন। কম রঞ্জন করলে ছায়ার মতো কোষ থাকে যা আলো বাড়ালে অদৃশ্য হয়ে যায়; ত্রিশ সেকেন্ড করে সময় বাড়ান। পুরু স্মিয়ার ঘন ওভারল্যাপ করা ভর তৈরি করে যেখানে কোনো সীমানা অনুসরণ করা যায় না; সমাধান হলো যান্ত্রিক, পরেরবার পাতলা করে ছড়ান, কারণ কোনো ধোয়া কোষের স্তূপ উদ্ধার করতে পারে না। বায়ুর বুদবুদ নিখুঁত বৃত্তের মতো তীক্ষ্ণ গাঢ় প্রান্তসহ দেখা যায় এবং নতুন শিক্ষার্থীরা এগুলোকে কাঠামো ভেবে ভুল করে; কভারস্লিপ ধীরে কোণে নামান। কোষের ওপর বা চারপাশে ছড়ানো ছোট গাঢ় বিন্দু সাধারণত স্বাভাবিক মৌখিক ব্যাকটেরিয়া, যেমন Ingrid Science cheek cell procedure-এর মতো স্কুল প্রোটোকলে উল্লেখ করা হয়েছে। এগুলো নিশ্চিত করে যে মুখে জীব আছে, যা শিক্ষার্থীদের মনে থাকতে পারে, কিন্তু এই অনুশীলনে এগুলোকে প্রজাতি পর্যায়ে শনাক্ত করা যায় না এবং এগুলোকে কোষের অংশ হিসেবে আঁকা উচিত নয়। খাদ্যের আবর্জনা এবং মিউকাসের সুতোর মতো অংশ অনিয়মিতভাবে এবং তীব্রভাবে রঞ্জিত হয়; এগুলো কমানোর জন্যই আগে মুখ ধোয়া হয়।

এই অনুশীলন কী করতে পারে না

এটি একটি শিক্ষামূলক পর্যবেক্ষণ, কোনো রোগ নির্ণয়ের পরীক্ষা নয়। শ্রেণিকক্ষের রঞ্জনে কোষের চেহারা সম্পর্কে কিছুই সংক্রমণ, ক্যান্সার বা কোনো রোগ নির্ণয় করতে পারে না এবং নিবন্ধটিকে এমন অর্থে পড়া উচিত নয়। প্রস্তুতিটি দুইটি বিবর্ধনে আকৃতি, সীমানা, সাইটোপ্লাজম এবং নিউক্লিয়াস দেখায়। এটি মেমব্রেনের আল্ট্রাস্ট্রাকচার, অঙ্গাণুর বিস্তারিত বা আণবিক পরিচয় দেখায় না। সীমাটি স্পষ্টভাবে বলা বিজ্ঞান এবং শিক্ষার্থী উভয়কেই সুরক্ষিত রাখে: ভালো ফলাফল হলো বিবর্ধন এবং রঞ্জকসহ সঠিকভাবে লেবেল করা অঙ্কন, স্বাস্থ্য সম্পর্কে কোনো সিদ্ধান্ত নয়।

শিক্ষার্থী ওয়ার্কশিট এবং লেবেলযুক্ত মাইক্রোগ্রাফ

এই পৃষ্ঠার দুটি প্রকল্প সম্পদ হলো উপরের লেবেলযুক্ত মাইক্রোগ্রাফ এবং নিচের ওয়ার্কশিট। প্রতি শিক্ষার্থীর জন্য একটি করে ওয়ার্কশিট মুদ্রণ করুন অথবা প্রজেক্ট করে শিক্ষার্থীদের নোটবুকে বাক্সগুলো অনুলিপি করতে বলুন।

45 মিনিটের সেশনে এটি কীভাবে ব্যবহার করবেন: নিরাপত্তা ব্রিফিং এবং নমুনা নেওয়ার জন্য দশ মিনিট, রঞ্জন ও মাউন্টিংয়ের জন্য দশ মিনিট, উভয় বিবর্ধনে পর্যবেক্ষণ এবং অঙ্কনের জন্য পনের মিনিট, চেকলিস্ট এবং লেবেলযুক্ত মাইক্রোগ্রাফের সঙ্গে তুলনার জন্য দশ মিনিট। চেকলিস্টের বিষয়গুলো ইচ্ছাকৃতভাবে যান্ত্রিক। পাতলা স্মিয়ার, সঠিক রঞ্জন সময়, সাইটোপ্লাজমের চেয়ে গাঢ় নিউক্লিয়াস, বিবর্ধন নথিভুক্ত। একজন শিক্ষার্থী যদি চারটিই পরীক্ষা করতে পারে, তবে সে সেই ধারণাটি বুঝেছে যা শেখানোর জন্য পাঠটি তৈরি: মাইক্রোস্কোপ পার্থক্য প্রদর্শন করে, এবং রঞ্জক সেই পার্থক