নিবন্ধ
DNA এবং RNA স্টেনিংয়ের জন্য মিথিলিন ব্লু: জেল ও মেমব্রেন প্রয়োগ
একজন শিক্ষার্থী একটি অ্যাগারোজ জেল চালায়, মিথিলিন ব্লু দিয়ে স্টেন করে এবং যেখানে উজ্জ্বল ব্যান্ড আশা করেছিল সেখানে কিছুই দেখতে পায় না। পাশের বেঞ্চে একজন পোস্টডক একই নীল বোতল দিয়ে Northern মেমব্রেন স্টেন করে তিন মিনিটে স্পষ্ট রাইবোসোমাল ব্যান্ড পায়। শিক্ষার্থী ধরে নেয় জেলটি ব্যর্থ হয়েছে। জেল ব্যর্থ হয়নি। দুটি কাজ আলাদা ছিল, এবং একই ডাই তাদের ভিন্ন সংবেদনশীলতা, ভিন্ন ব্যাকগ্রাউন্ড এবং পরবর্তী ব্যবহারের ভিন্ন নিয়মের মাধ্যমে উত্তর দেয়।
মিথিলিন ব্লু DNA স্টেন এবং মিথিলিন ব্লু RNA স্টেনিং একই রসায়ন ভাগ করে, কিন্তু উদ্দেশ্য ভাগ করে না। জেলে ডাইটি একটি ছিদ্রযুক্ত ম্যাট্রিক্সের ভিতরে কত নিউক্লিক অ্যাসিড আছে তা দেখায়। মেমব্রেনে এটি দেখায় ট্রান্সফার সঠিক হয়েছে কি না এবং লেনগুলো সমানভাবে লোড হয়েছে কি না। এই পার্থক্য পরিষ্কার হলে প্রোটোকল, শনাক্তকরণ সীমা এবং সামঞ্জস্যের সীমাগুলো সহজে বোঝা যায়।
সংক্ষিপ্ত উত্তর
মিথিলিন ব্লু একটি সমতল ক্যাটায়নিক ডাই, যা নিউক্লিক অ্যাসিডের সঙ্গে নন-কোভ্যালেন্ট এবং বিপরীতযোগ্যভাবে যুক্ত হয়। এর মধ্যে ফসফেটের সঙ্গে তড়িৎ-আকর্ষণ, বেস জোড়ার মাঝে intercalation এবং minor groove association অন্তর্ভুক্ত। এই বিপরীতযোগ্যতাই গুরুত্বপূর্ণ। ব্যান্ড দৃশ্যমান আলোতে স্টেন করা যায়, নথিভুক্ত করা যায় এবং পরে destain বা পরিষ্কার করে cloning, hybridization অথবা পুনরায় প্রোবিংয়ের জন্য ব্যবহার করা যায়।
ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড DNA-এর জন্য মিথিলিন ব্লু agarose gel staining-এর প্রচলিত দ্রুত পদ্ধতি হলো পানিতে 0.02 শতাংশ w/v (200 micrograms per mL), প্রায় 15 মিনিট স্টেনিং এবং প্রায় 15 মিনিট পানি দিয়ে destaining, তারপর white light box-এ দেখা। মেমব্রেনের জন্য প্রচলিত Northern blot পদ্ধতিতে প্রায় 0.02 থেকে 0.04 শতাংশ ডাই sodium acetate-এর কাছে pH 5.2-এ ব্যবহার করা হয়। সংবেদনশীলতা সীমিত: ভালো অবস্থায় একটি জেল ব্যান্ডে দশ থেকে শত শত nanograms পর্যন্ত, এবং রক্ষণশীল নির্দেশিকায় 0.5 থেকে 1 microgram উল্লেখ করা হয়। এটি ethidium bromide এবং SYBR স্টেনের তুলনায় অনেক কম সংবেদনশীল। মেমব্রেনে নির্দিষ্ট transcript শনাক্তকরণের জন্য একক সীমা নির্ধারণ করা যায় না, কারণ ডাই প্রধানত প্রচুর পরিমাণে থাকা ribosomal RNA এবং মোট লোড করা উপাদান দেখায়।
কোনো retail supplement solution ব্যবহার করে এই পদ্ধতি প্রতিস্থাপন করবেন না। যাচাইকৃত পদ্ধতি analytical grade dye, নির্ধারিত buffer এবং RNA ব্যবহারের ক্ষেত্রে RNase-free handling ধরে নেয়।
কীভাবে binding কাজ করে এবং কোথায় বিভ্রান্তি তৈরি হয়
কার্যকর মডেলটির তিনটি অংশ আছে। প্রথমত, ধনাত্মক চার্জযুক্ত ring system নেতিবাচক চার্জযুক্ত phosphate backbone-এর প্রতি আকৃষ্ট হয়। দ্বিতীয়ত, কিছু GC preference দেখা যায়, তবে routine staining sequence specific নয়। তৃতীয়ত, single stranded DNA এবং RNA প্রধানত electrostatic interaction এবং accessible base-এর সঙ্গে stacking-এর মাধ্যমে যুক্ত হয়।
এর দুটি ফলাফল আছে। Binding noncovalent হওয়ায় ডাই ধুয়ে যায়। Polyacrylamide band দ্রুত ফিকে হয়ে যায়, তাই স্থায়ী রেকর্ডের জন্য আলাদা fixation variant ব্যবহৃত হয়। আবার ডাইটি photosensitizer হওয়ায় দীর্ঘ সময় উজ্জ্বল আলোতে রাখলে guanine oxidation হতে পারে এবং strand ক্ষতি হতে পারে। সংক্ষিপ্ত white light viewing সাধারণত preparative recovery-এর জন্য উপযোগী, তবে আলো ব্যবহারের সময় কম রাখা উচিত।
বিস্তারিত photochemistry-এর জন্য দেখুন the two pathways in methylene blue photochemistry। redox pair এবং charge state-এর জন্য দেখুন the chemistry of methylene blue structure and properties।
কাজ এক: জেলের ভিতরে staining
জেল staining একটি প্রশ্নের উত্তর দেয়: এই band-এ চোখে দেখার মতো পর্যাপ্ত nucleic acid আছে কি?
ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড DNA in agarose সবচেয়ে ভালোভাবে অধ্যয়ন করা ক্ষেত্র। Flores এবং সহকর্মীদের মূল methylene blue gel method 1 শতাংশ agarose-এ 0.02 শতাংশ দ্রুত প্রোটোকল যাচাই করে এবং পরবর্তী recovery ও cloning সফল দেখায়।
ব্যবহারিক কার্যপ্রবাহ:
- স্বাভাবিকভাবে gel চালান।
- 0.02 শতাংশ w/v methylene blue in distilled water-এ প্রায় 15 মিনিট হালকা agitation সহ ডুবিয়ে রাখুন।
- পানি কয়েকবার বদলে destain করুন যতক্ষণ background কমে এবং band স্পষ্ট হয়।
- white light illuminator-এ দ্রুত ছবি তুলুন।
Agarose এবং polyacrylamide আলাদাভাবে আচরণ করে। Agarose ম্যাট্রিক্সে ডাই ধরে রাখে, তাই destaining ধীর ধাপ। Thin polyacrylamide gel দ্রুত stain হয় এবং দ্রুত ডাই হারায়, যা preparative excision-এর জন্য সহায়ক হলেও archival record-এর জন্য কম সুবিধাজনক।
DNA এবং RNA-এর পার্থক্য গুরুত্বপূর্ণ। Double stranded DNA সবচেয়ে শক্তিশালী structured binding দেয়। RNA এবং single stranded DNA stain হয়, তবে দুর্বল এবং কম পূর্বানুমানযোগ্যভাবে। Formaldehyde agarose RNA gel-এর ক্ষেত্রে অধিকাংশ ল্যাব RNA-কে আগে মেমব্রেনে স্থানান্তর করে, কারণ এতে দুর্বল gel signal-এর পরিবর্তে পরিষ্কার membrane signal এবং loading record পাওয়া যায়।
কাজ দুই: মেমব্রেনে staining
মেমব্রেন staining ভিন্ন প্রশ্নের উত্তর দেয়: transfer হয়েছে কি এবং lane-গুলো তুলনাযোগ্য কি?
প্রচলিত প্রয়োগ হলো reversible Northern blot stain। Herrin এবং Schmidt-এর পদ্ধতিতে মূলত 0.04 শতাংশ dye, 50 mM sodium acetate এবং pH 5.0 ব্যবহার করা হয়।
আধুনিক রূপ:
- RNA বা denatured DNA nylon বা nitrocellulose-এ transfer করুন এবং UV crosslinking বা baking-এর মাধ্যমে immobilize করুন।
- প্রয়োজন হলে membrane-কে 5 শতাংশ acetic acid-এ প্রায় 15 মিনিট ভিজিয়ে নিন।
- 0.02 থেকে 0.04 শতাংশ methylene blue in 0.3 থেকে 0.5 M sodium acetate near pH 5.2-এ 5 থেকে 10 মিনিট stain করুন।
- পানি দিয়ে rinse ও destain করুন, document করুন, তারপর hybridization-এর আগে অবশিষ্ট dye সরান।
Positively charged nylon Northern work-এ বেশি ব্যবহৃত হয়। Nitrocellulose-ও একই acetic acid এবং acetate workflow-এ কাজ করে।
Detection limits এবং background
তুলনাটি আনুমানিক। ফলাফল gel percentage, band width, optics এবং destaining-এর উপর নির্ভর করে।
| Stain এবং format | আনুমানিক detection per band | ব্যাখ্যা |
|---|---|---|
| Methylene blue, dsDNA in agarose | 40 to 250 ng optimized; 0.5 to 1 microgram conservative | Preparative load এবং teaching gel-এর জন্য যথেষ্ট। খুব কম পরিমাণ band-এর জন্য দুর্বল। |
| Methylene blue, short ssDNA বা RNA বা oligos in PAGE | Roughly 0.1 to 0.5 microgram | দৈর্ঘ্য এবং structure নির্ভর। |
| Ethidium bromide, dsDNA agarose | About 1 to 10 ng | Methylene blue-এর তুলনায় বেশি সংবেদনশীল। |
| SYBR Green I, dsDNA | About 60 pg | Fluorescence imaging প্রয়োজন। |
| SYBR Gold, DNA এবং RNA | About 25 pg | অত্যন্ত সংবেদনশীল। |
| Silver stain, PAGE nucleic acids | About 0.3 to 0.9 ng | খুব সংবেদনশীল কিন্তু recovery কঠিন। |
| Toluidine blue, PAGE RNA এবং oligos | Hundreds of ng working amounts | Methylene blue-এর মতো দৃশ্যমান আলো ব্যবহার করে। |
Background নিয়ন্ত্রণ নির্ধারণ করে signal ব্যবহারযোগ্য কি না। মুক্ত ডাই খুব রঙিন, তাই contrast আসে unbound dye সরানো এবং bound dye ধরে রাখার ভারসাম্য থেকে। বেশি concentrated stain সাধারণত sensitivity বাড়ায় না; বরং destaining সময় বাড়ায়।
Compatibility সীমা
Blue staining-এর পরে cloning সম্ভব বলে প্রদর্শিত হয়েছে। Flores এবং সহকর্মীরা stained agarose band থেকে DNA উদ্ধার করে ligate এবং transform করেছেন। সম্ভাব্য কারণ হলো কম photodamage, ডাইয়ের নিজস্ব কোনো সুবিধা নয়।
PCR এবং sequencing-এর ক্ষেত্রে প্রমাণ সীমিত। অবশিষ্ট ডাই nucleic acid-এর সঙ্গে যুক্ত হতে পারে, তাই enzymatic step-এর আগে destain এবং cleanup করা উচিত।
Blot hybridization-এ সঠিক ক্রম গুরুত্বপূর্ণ:
transfer → immobilize → stain → document → destain → hybridize
এই ক্রম Herrin এবং Schmidt-এর নকশার অংশ। staining আগে করা বা destaining বাদ দেওয়া হলে সেটি আলাদা পদ্ধতি এবং আলাদা validation প্রয়োজন।
বারবার দেখা যায় এমন সমস্যা
ফিকে gel band সাধারণত বোঝায় colorimetric stain-এর জন্য mass খুব কম, বিশেষ করে short single stranded বা RNA target-এর ক্ষেত্রে। বেশি load ব্যবহার করুন, fresh stain নিন, destaining আগে বন্ধ করুন।
সম্পূর্ণ নীল gel কিন্তু contrast নেই মানে সাধারণত overstaining বা অপর্যাপ্ত water change। PAGE band ফিকে হওয়া স্বাভাবিক chemistry, ব্যর্থ stain নয়।
অসম membrane background সাধারণত fold, bubble, fingerprint, uneven agitation বা patchy transfer-এর কারণে হয়। Hybridization control ছাড়া এটিকে unequal loading হিসেবে ব্যাখ্যা করবেন না।
Safety এবং handling
Methylene blue ethidium bromide-এর তুলনায় সহজে handle করা যায়, কিন্তু এটি নিরীহ নয়। বর্তমান MilliporeSigma safety data sheet অনুযায়ী এটি acute oral toxicity Category 4 হিসেবে শ্রেণিবদ্ধ এবং গিলে ফেললে ক্ষতিকর হতে পারে।
Ethidium bromide-এর genotoxicity warning আরও শক্তিশালী। উভয়ের ক্ষেত্রেই SDS এবং প্রতিষ্ঠানের নিয়ম অনুসরণ করুন।
শেষ বেঞ্চের নিয়মটি মনে রাখুন। Gel উচ্চ load-এ white light-এর নিচে দৃশ্যমানতা পরীক্ষা করে। Membrane transfer এবং loading পরীক্ষা করে, তারপর probe সংবেদনশীল কাজটি করে। একই dye দুই ক্ষেত্রেই ব্যবহৃত হয়, তবে সীমিত sensitivity, reversible binding এবং সঠিক কাজের ক্রম অপরিহার্য।