নিবন্ধ
অ্যাসিড-ফাস্ট কাউন্টারস্টেইন হিসেবে মিথিলিন ব্লু কেন ব্যবহার করা হয়
একজন প্রযুক্তিবিদ সম্পূর্ণ স্টেইনিং ক্রমের পর একটি স্পুটাম স্মিয়ার পরীক্ষা করেন। নীল ক্ষেত্রের বিপরীতে লাল রডগুলো স্পষ্ট দেখা যায় এবং রিপোর্টে অ্যাসিড-ফাস্ট ব্যাসিলি দেখা গেছে বলে লেখা হয়। পরের দিন একটি ভিন্ন স্লাইডে সমান নীল ক্ষেত্র দেখা যায়, যেখানে কোনো লাল রড নেই, এবং সেটিকে যক্ষ্মার জন্য নেগেটিভ হিসেবে রিপোর্ট করা হয়। এই রিপোর্টগুলোর একটি স্লাইড যা সমর্থন করে তার চেয়ে বেশি দাবি করে, এবং এটি প্রথমবার নয়।
বিভ্রান্তিটি ধারণাগত। প্রযুক্তিবিদ নীল রঞ্জককে শনাক্তকরণ রসায়নের অংশ হিসেবে বিবেচনা করেছেন, যেন মিথিলিন ব্লু মাইকোব্যাকটেরিয়া খুঁজে পেতে সাহায্য করে। এটি করে না। মিথিলিন ব্লু স্লাইডে পৌঁছানোর সময় পরীক্ষা ইতিমধ্যেই শেষ। রঞ্জকটি শুধু পটভূমি রঙ করে যাতে ফলাফল পড়া যায়। এই নিবন্ধে অ্যাসিড-ফাস্ট স্টেইনিংয়ে মিথিলিন ব্লুর উদ্দেশ্য, কেন এটি অন্য কোনো রঙের পরিবর্তে নীল, এবং নীলের বিপরীতে লাল আপনাকে কী সিদ্ধান্ত নিতে দেয় তা ব্যাখ্যা করা হয়েছে।
সংক্ষিপ্ত উত্তর
অ্যাসিড-ফাস্ট স্টেইনিং একটি ডিফারেনশিয়াল পরীক্ষা, যা তিনটি ধারণার ওপর ভিত্তি করে তৈরি। প্রাইমারি স্টেইন কার্বোল ফিউক্সিন সব কোষে প্রবেশ করানো হয়, যার মধ্যে মোমজাতীয় মাইকোব্যাকটেরিয়াও রয়েছে। ডিকালারাইজার অ্যাসিড-অ্যালকোহল সাধারণ কোষ থেকে লাল রঞ্জক সরিয়ে দেয়, কিন্তু অ্যাসিড-ফাস্ট কোষ থেকে তা বের করতে ব্যর্থ হয়। এরপর কাউন্টারস্টেইন মিথিলিন ব্লু সেই সব অংশ রঙ করে যেগুলো থেকে ডিকালারাইজার রঙ সরিয়ে দিয়েছে, ফলে নন-অ্যাসিড-ফাস্ট কোষ, হোস্ট কোষ এবং ধ্বংসাবশেষ নীল দেখায়, আর অ্যাসিড-ফাস্ট ব্যাসিলি লাল থাকে। কাউন্টারস্টেইন কনট্রাস্ট সরবরাহ করে। এটি কোনো কোষকে অ্যাসিড-ফাস্ট করে তোলার রসায়নে অংশ নেয় না।
প্রতিটি ধাপ কী করে
নিচের ডায়াগ্রামটি কাজের বিভাজন দেখায়। এটিকে বাম থেকে ডানে একটি প্রক্রিয়া হিসেবে পড়ুন এবং নিচের স্ট্রিপটিকে মনে রাখার উপায় হিসেবে পড়ুন যে প্রতিটি স্টেইনিং পরিবার ভিন্ন প্রশ্ন করে।
প্রথমে প্রবেশ করানো হয়। মাইকোব্যাকটেরিয়া সাধারণ জলীয় রঞ্জক প্রতিরোধ করে কারণ তাদের আবরণ অস্বাভাবিকভাবে হাইড্রোফোবিক, তাই প্রোটোকল জোর করে প্রবেশ ঘটায়। Ziehl-Neelsen পদ্ধতিতে তাপীয় বাষ্পীকরণ ফেনলযুক্ত কার্বোল ফিউক্সিনকে মোমজাতীয় প্রাচীরের মধ্য দিয়ে প্রবেশ করায়। Kinyoun ঠান্ডা পদ্ধতিতে তাপের পরিবর্তে অনেক শক্তিশালী প্রাইমারি স্টেইন ফর্মুলেশন ব্যবহার করা হয়, এবং কিছু পরিবর্তিত তাপহীন সংস্করণে সার্ফ্যাকট্যান্ট যোগ করা হয়। American Society for Microbiology acid-fast stain protocols উভয় ফর্মুলেশন পাশাপাশি নথিভুক্ত করেছে, এবং ঘনত্বের পার্থক্য উল্লেখযোগ্য: উত্তপ্ত পদ্ধতিতে প্রতি 100 mL-এ প্রায় 0.3 g বেসিক ফিউক্সিন, যেখানে ঠান্ডা পদ্ধতিতে প্রায় 4 g।
দ্বিতীয় ধাপে পার্থক্য নির্ধারণ হয়। অ্যাসিড-অ্যালকোহল, সাধারণত 97 mL 95 শতাংশ ইথানলে 3 mL ঘন হাইড্রোক্লোরিক অ্যাসিড, এমন সব কোষ থেকে লাল রঞ্জক ধুয়ে সরিয়ে দেয় যাদের প্রাচীর বিশেষ প্রতিরোধ প্রদান করে না। অক্ষত মাইকোব্যাকটেরিয়াল লিপিড আবরণযুক্ত কোষ রঞ্জক ধরে রাখে। পুরো পদ্ধতি এই ধাপের ওপর নির্ভর করে এবং নিচে আলোচনা করা হয়েছে, এটি প্রযুক্তিগত দক্ষতার প্রতি সবচেয়ে সংবেদনশীল ধাপ।
শেষে আসে কনট্রাস্ট। স্লাইডে এখন প্রায় বর্ণহীন পটভূমিতে লাল অ্যাসিড-ফাস্ট কোষ থাকে, যেখান থেকে রঞ্জক সরানো হয়েছে। মিথিলিন ব্লু 0.3 শতাংশ w/v ঘনত্বে সেই পটভূমিকে আবার দৃশ্যমান করে এবং লালের থেকে সর্বাধিক আলাদা রঙ প্রদান করে। কাউন্টারস্টেইনিং সংক্ষিপ্ত হয়, সাধারণত উত্তপ্ত পদ্ধতিতে 20 থেকে 30 সেকেন্ড এবং কিছু ঠান্ডা পদ্ধতির সংস্করণে কয়েক মিনিট পর্যন্ত, এবং সময় নির্ধারণ রঞ্জকের বৈশিষ্ট্য নয়, বরং প্রোটোকল নির্ভর।
কেন এই রঞ্জক, এবং কেন নীল
মিথিলিন ব্লু একটি ক্যাটায়নিক বেসিক ডাই, যার অর্থ এর রঙিন আয়ন ধনাত্মক চার্জ বহন করে এবং ডিকালারাইজড ব্যাকটেরিয়া, হোস্ট কোষ ও ধ্বংসাবশেষের ঋণাত্মক চার্জযুক্ত পৃষ্ঠের সঙ্গে যুক্ত হয়। OpenStax Microbiology বেসিক স্টেইনের সাধারণ নীতি হিসেবে এই চার্জের যুক্তি ব্যাখ্যা করে। তবে মিথিলিন ব্লু এখানে রাসায়নিকভাবে অনন্য নয়। ক্রিস্টাল ভায়োলেট এবং স্যাফ্রানিনও বেসিক ডাই। পছন্দটি রাসায়নিক নয়, অপটিক্যাল।
লাল রডের জন্য বিপরীত রঙের পটভূমি দরকার, এবং উজ্জ্বল-ক্ষেত্র মাইক্রোস্কোপিতে নীল লালের বিপরীতে সবচেয়ে কার্যকরভাবে অবস্থান করে। স্যাফ্রানিন দুর্বল কাউন্টারস্টেইন হবে কারণ এর গোলাপি-লাল শেষ রঙ ধরে রাখা কার্বোল ফিউক্সিনের খুব কাছাকাছি, ফলে পদ্ধতিটি যে পার্থক্য তৈরি করেছে তা নষ্ট হয়ে যায়। ক্রিস্টাল ভায়োলেট একটি গাঢ় বেগুনি পটভূমি তৈরি করবে যা পাতলা লাল ব্যাসিলির সঙ্গে প্রতিযোগিতা করবে। রসায়নের পরিবর্তে কাজটি যে কনট্রাস্টের, তার সবচেয়ে শক্তিশালী প্রমাণ হলো প্রতিস্থাপন: ম্যালাকাইট গ্রিন এবং ব্রিলিয়ান্ট গ্রিনের মতো সবুজ কাউন্টারস্টেইন কিছু ভেটেরিনারি ও পরিবর্তিত প্রোটোকলে ব্যবহৃত হয় এবং পরীক্ষা তবুও কাজ করে, কারণ যেকোনো স্পষ্টভাবে ভিন্ন রঙ একই কাজ করে।
দুটি ব্যবহারিক ফলাফল অনুসরণ করে। প্রথমত, মানক রেসিপিতে pH সমন্বয়ের কথা বলা নেই; এই সাধারণ জলীয় 0.3 শতাংশ দ্রবণকে ক্ষারীয় ফর্মুলেশন যেমন Loeffler's methylene blue-এর সঙ্গে গুলিয়ে ফেলবেন না, যা ভিন্ন স্টেইনিং ধারণার অন্তর্ভুক্ত। দ্বিতীয়ত, অতিরিক্ত ব্যবহার ক্ষতিকর। হিস্টোলজি সাহিত্য বিশেষভাবে সতর্ক করে যে অত্যধিক ঘন নীল পটভূমি অল্প সংখ্যক ব্যাসিলিকে আড়াল করতে পারে, তাই প্রোটোকলের অনুমোদিত সময়ের চেয়ে বেশি সময় স্লাইড ভিজিয়ে রাখা কোনো অতিরিক্ত সুবিধা ছাড়াই পাঠযোগ্যতা কমায়।
যে প্রাচীর রসায়ন পরীক্ষাটি সম্ভব করে
অ্যাসিড-অ্যালকোহল কেন পার্থক্য করতে পারে তার কারণ মাইকোব্যাকটেরিয়াল আবরণে রয়েছে। এর কাঠামোগত মূল হলো mycolyl-arabinogalactan-peptidoglycan complex: পেপটিডোগ্লাইকান আরাবিনোগ্যাল্যাকটানের সঙ্গে যুক্ত, যার বাইরের প্রান্তে দীর্ঘ চেইনের মাইকোলিক অ্যাসিড থাকে, যা অস্বাভাবিকভাবে কম পারমিয়াবিলিটির একটি লিপিড-সমৃদ্ধ বাইরের মাইকোমেমব্রেন তৈরি করে। review of the mycobacterial outer membrane এই গঠন বিস্তারিতভাবে ব্যাখ্যা করে। বাধাটি উভয় দিকেই কাজ করে। এটি রঞ্জক প্রবেশ প্রতিরোধ করে, যার কারণে তাপ বা শক্তিশালী প্রাইমারি স্টেইন দরকার হয়, এবং এটি রঞ্জক অপসারণ প্রতিরোধ করে, যার কারণে অ্যাসিড-অ্যালকোহল ভেতরে প্রবেশ করা কার্বোল ফিউক্সিন সরাতে ব্যর্থ হয়। সাধারণ ব্যাকটেরিয়ায় এই আবরণ নেই এবং তারা রঞ্জক হারায়। তাই অ্যাসিড-ফাস্ট বৈশিষ্ট্যকে মাইকোলিক অ্যাসিডের সঙ্গে ফিউক্সিনের রাসায়নিক বন্ধন নয়, বরং লিপিড বাধার ঘটনা হিসেবে বোঝা উচিত।
এই রসায়ন আরেকটি সাধারণ প্রশ্নের উত্তর দেয়: মাইকোব্যাকটেরিয়া গ্রাম পদ্ধতিতে দুর্বল ও অনির্দেশ্যভাবে স্টেইন হয়, কখনও ফিকে দানাদার রূপ বা রঞ্জকহীন ছায়ার মতো দেখা যায়। তাদের হাইড্রোফোবিক প্রাচীর ক্রিস্টাল ভায়োলেট প্রবেশ সীমিত করে। অ্যাসিড-ফাস্ট স্টেইন পরিবর্তিত গ্রাম স্টেইন নয়। এটি ভিন্ন প্রাচীর বৈশিষ্ট্যের ওপর ভিত্তি করে তৈরি একটি ভিন্ন ডিফারেনশিয়াল নীতি, যেমন the simple stain versus Gram stain comparison-এ অন্য দুটি পদ্ধতির জন্য দেখানো হয়েছে।
তিনটি পদ্ধতি, তিনটি প্রশ্ন
| Method | Test performed | Positive endpoint | What the result proves |
|---|---|---|---|
| Simple stain (e.g. methylene blue alone) | None; one dye colors all cells | Blue cells of a given shape | Morphology only: shape and arrangement, no classification |
| Gram stain | Alcohol or acetone challenge of the crystal violet iodine complex | Purple (positive) vs pink (negative) | Envelope behavior under solvent extraction; a classification into two wall types |
| Acid-fast stain | Acid-alcohol challenge of carbol fuchsin forced into waxy walls | Red (acid-fast) vs blue (non-acid-fast) | Retention against acid-alcohol; acid-fastness, which is consistent with mycobacteria but is not species identification |
এক-রঞ্জক ব্যাকটেরিয়াল পদ্ধতির বৃহত্তর পরিবারের জন্য দেখুন the microscopy staining atlas।
নীলের বিপরীতে লাল কী প্রমাণ করতে পারে না
লাল রডের অর্থ হলো জীবগুলো অ্যাসিড-অ্যালকোহলের মাধ্যমে কার্বোল ফিউক্সিন ধরে রেখেছে। এই ফলাফল Mycobacterium tuberculosis-এর সঙ্গে সামঞ্জস্যপূর্ণ, কিন্তু CDC tuberculosis diagnostic guidance স্পষ্টভাবে উল্লেখ করে যে অন্যান্য মাইকোব্যাকটেরিয়াও অ্যাসিড-ফাস্ট, তাই প্রজাতি শনাক্তকরণের জন্য রঙ নয়, কালচার এবং নিউক্লিক অ্যাসিড পরীক্ষা প্রয়োজন।
প্রযুক্তিগত ত্রুটিগুলো দুইটি ধোয়ার ধাপে বেশি দেখা যায়। অপর্যাপ্ত ডিকালারাইজেশন পটভূমির উপাদানকে লাল রেখে দেয় এবং ভুল পজিটিভ পাঠের সম্ভাবনা বাড়ায়। অতিরিক্ত ডিকালারাইজেশন দুর্বলভাবে ধরে রাখা প্রাইমারি স্টেইন সরিয়ে দেয় এবং ভুল নেগেটিভে অবদান রাখে। অতিরিক্ত ভারী কাউন্টারস্টেইন অল্প সংখ্যক ব্যাসিলিকে নীলের মধ্যে ঢেকে দেয়। পুরু স্মিয়ার, জমাট বাঁধা রিএজেন্ট এবং দূষিত ধোয়ার পানি নিজস্ব আর্টিফ্যাক্ট যোগ করে।
জীবের পরিমাণ যাই হোক, সংবেদনশীলতা সীমাবদ্ধ থাকে। প্রচলিত স্মিয়ার মাইক্রোস্কোপিতে প্রতি মিলিলিটার স্পুটামে প্রায় 5,000 থেকে 10,000 ব্যাসিলি প্রয়োজন হয়, এবং পুরোনো CDC প্রমাণ পর্যালোচনায় কালচার নিশ্চিত পালমোনারি কেসগুলোর মধ্যে স্মিয়ার সংবেদনশীলতা প্রায় 45 থেকে 80 শতাংশ বলা হয়েছে। তাই নেগেটিভ স্মিয়ার কখনোই যক্ষ্মা বাদ দেয় না। বর্তমান CDC নির্দেশনা প্রতিটি স্মিয়ারের সঙ্গে কালচার বজায় রাখে এবং পালমোনারি যক্ষ্মা বিবেচনা করা হলে ও ফলাফল ব্যবস্থাপনা পরিবর্তন করতে পারে এমন পরিস্থিতিতে অন্তত একটি শ্বাসযন্ত্রের নমুনায় নিউক্লিক অ্যাসিড অ্যামপ্লিফিকেশন টেস্টের পরামর্শ দেয়।
ব্যবহারিক কাজ অনুমোদিত প্রোটোকলের অন্তর্ভুক্ত
শিক্ষামূলক বর্ণনা, এই নিবন্ধসহ, ক্লিনিক্যাল কাজের অনুমোদন দেয় না। ল্যাবরেটরি অনুশীলনের জন্য বর্তমান CDC, APHL বা CLSI নথির সঙ্গে সামঞ্জস্যপূর্ণ ল্যাবরেটরির যাচাইকৃত স্ট্যান্ডার্ড অপারেটিং প্রসিডিউর অনুসরণ করুন; CDC acid-fast staining reference held in its Stacks archive দেখায় কীভাবে এই ধরনের প্রক্রিয়ায় রিএজেন্ট এবং রিডআউট নির্দিষ্ট করা হয়। যক্ষ্মা নমুনার কাজে নিয়ন্ত্রণ ব্যবস্থা প্রয়োজন: স্মিয়ার প্রস্তুত করা হয় বায়োলজিক্যাল সেফটি ক্যাবিনেটে, কারণ প্রস্তুতির সময় অ্যারোসোল ও ছিটকে পড়া তৈরি হয়, এবং CDC ল্যাবরেটরি সেফটি নির্দেশনা বলে যে তাপ-স্থির করা স্মিয়ারেও জীবিত টিউবারকেল ব্যাসিলি থাকতে পারে এবং সেগুলোকে দূষিত হিসেবে পরিচালনা করতে হবে। CDC Public Health Image Library entry for a carbol-fuchsin and methylene blue smear examined for M. leprae যক্ষ্মার বাইরেও পদ্ধতির পরিসর মনে করিয়ে দেয়: যেখানে অ্যাসিড-ফাস্ট জীব খোঁজা হয়, সেখানে একই লাল-নীল কনট্রাস্ট ব্যবহৃত হয়, এবং সতর্ক নেগেটিভ পাঠ নিজেই রেকর্ড করার মতো ফলাফল।
সম্পূর্ণ স্লাইড পড়া
স্ক্রিনিংয়ের সময় কাউ