নিবন্ধ
লেফলারের ক্ষারীয় এবং পলিক্রোম মিথিলিন ব্লু স্টেইন ব্যাখ্যা
একটি স্টেইনিং বেঞ্চে তিনটি বোতল পাশাপাশি থাকতে পারে, প্রতিটির লেবেলে মিথিলিন ব্লুর কোনো না কোনো রূপ লেখা। একটিতে লেখা থাকে aqueous methylene blue 1%। একটিতে Loeffler's alkaline methylene blue। একটিতে polychrome methylene blue। ব্যস্ত কর্মী কাছের বোতলটিই তুলে নেন। এরপর স্মিয়ারটি খুব হালকা রঙ ধারণ করে, অথবা সমানভাবে নীল হয়ে যায়, অথবা প্রত্যাশিত নয় এমন বেগুনি আভা দেখা যায়, এবং ফলাফলের দোষ দেওয়া হয় নমুনাকে।
এটি নমুনার সমস্যা নয়, এটি ফর্মুলেশনের সমস্যা। তিনটি দ্রবণেই সম্পর্কিত রঞ্জক রয়েছে, কিন্তু এগুলো ভিন্ন ভিন্ন স্টেইনিং ধারণার প্রতিনিধিত্ব করে। একটি প্রায় নিরপেক্ষ pH-তে থাকা সাধারণ ক্যাটায়নিক রঞ্জক। একটি একই রঞ্জক, যাকে ক্ষার দিয়ে আরও সক্রিয় করা হয়েছে। আরেকটি আর একক রঞ্জক নয়, বরং ইচ্ছাকৃতভাবে অক্সিডাইজ করা একটি মিশ্রণ। ভুলটি ব্যবহার করলে স্টেইনিং নীতি আপনার হাতে বদলে যায়।
সংক্ষিপ্ত উত্তর
সাধারণ aqueous methylene blue হলো ভিত্তি: পানিতে প্রায় 1% রঞ্জক, ব্যাকটেরিয়ার গঠন ও সাধারণ মাইক্রোস্কোপির জন্য একটি সরল ক্যাটায়নিক স্টেইন। Loeffler's alkaline methylene blue পানিতে মিশ্রিত অ্যালকোহলিক স্টক দ্রবণে অল্প পরিমাণ পরিমিত ক্ষার যোগ করে তৈরি করা হয়, যা pH বাড়ায় এবং ক্যাটায়নিক রঞ্জককে অম্লীয় ব্যাকটেরিয়াল কাঠামোর দিকে আরও শক্তভাবে আকর্ষণ করে। Polychrome methylene blue হলো এমন মিথিলিন ব্লু যা ক্ষারের মধ্যে ইচ্ছাকৃতভাবে পরিপক্ব করা হয়েছে, ফলে বোতলে থাকে ডিমিথাইলেটেড হোমোলগের মিশ্রণ (azure A, azure B, azure C), thionin এবং methylene violet-এর সঙ্গে অবশিষ্ট methylene blue; এই মিশ্রণ বিভিন্ন কাঠামোকে বিভিন্ন রঙে স্টেইন করে।
শুধু একটি বাক্য মনে রাখলে: ক্ষারীয়করণ স্টেইনিংয়ের তীব্রতা পরিবর্তন করে, আর পলিক্রোমিং স্টেইনের রঙ পরিবর্তন করে।
সাধারণ aqueous methylene blue: রেফারেন্স পয়েন্ট
সবচেয়ে সরল ফর্মুলেশন হলো পানিতে মিথিলিন ব্লু দ্রবীভূত করা, সাধারণত 1% w/v ঘনত্বে, ক্ষার ছাড়া এবং অক্সিডেশন ছাড়া। রঙিন প্রজাতিটি হলো methylthioninium cation এবং chloride counterion সহ একটি ছোট সমতল phenothiazine রঞ্জক, যা PubChem's methylene blue record-এ methylthioninium chloride হিসেবে বর্ণিত হয়েছে। ক্যাটায়ন হিসেবে এটি নিউক্লিক অ্যাসিডের phosphate backbone এবং ব্যাকটেরিয়ার কোষপ্রাচীরের অম্লীয় গ্রুপের সঙ্গে যুক্ত হয়ে কোষকে হালকা পটভূমির বিপরীতে নীল রঙ দেয়।
এর প্রধান সুবিধা হলো পূর্বানুমেয়তা। নিউক্লিয়াস ও ব্যাকটেরিয়া নীল দেখা যায়। কনট্রাস্ট মাঝারি। দুর্বলভাবে দৃশ্যমান জীবগুলো হালকা স্টেইন হতে পারে, এবং ঠিক এই সীমাবদ্ধতাই Loeffler সমাধান করতে চেয়েছিলেন। সাধারণ ব্যাকটেরিয়াল স্টেইনের এই বিস্তৃত পরিবারের জন্য এই দ্রবণটি যেখানে পড়ে, তার একটি ওভারভিউ দেখুন bacterial simple staining-এ। পরিচয় নির্ভুল রাখা এখনও গুরুত্বপূর্ণ: methyl blue সম্পূর্ণ ভিন্ন অণু, যেমন methyl blue versus methylene blue ব্যাখ্যা করে, তাই শুধু রঙের নাম দিয়ে ক্যাটালগ অনুসন্ধান করলে ভুল রঞ্জক শ্রেণি পাওয়া যেতে পারে।
Loeffler's alkaline methylene blue: একই রঞ্জক, আরও শক্তিশালী করা
ক্লাসিক Loeffler ফর্মুলায় অ্যালকোহলিক methylene blue stock-এর সঙ্গে পানিতে মিশ্রিত dilute alkali যোগ করা হয়। পাঠ্যপুস্তকের সংস্করণে 95% ethanol-এ 30 mL-এ 0.3 g রঞ্জক এবং 100 mL 0.01% aqueous potassium hydroxide (অথবা সমতুল্যভাবে 30 mL saturated alcoholic methylene blue, 100 mL distilled water এবং 1 mL 1% KOH) দেওয়ার কথা বলা হয়, যা প্রায় 0.3% রঞ্জক এবং স্পষ্ট ক্ষারীয় pH-এর কার্যকর দ্রবণ তৈরি করে। বাণিজ্যিক সংস্করণ একই নীতি অনুসরণ করে, এবং Thermo Fisher microbiology stains catalog-এ Loeffler's alkaline methylene blue-কে polychrome এবং aqueous variant-এর পাশাপাশি পৃথক ক্যাটালগ আইটেম হিসেবে তালিকাভুক্ত করা হয়েছে, যাদের উদ্দেশ্যও আলাদা।
ক্ষারই এখানে সক্রিয় ধারণা। pH বাড়লে নমুনার carboxyl এবং phosphate গ্রুপ deprotonate হয়, ফলে ঋণাত্মক সাইটের ঘনত্ব বাড়ে; একই সময়ে ethanol stock রঞ্জককে সম্পূর্ণ দ্রবীভূত রাখে, যাতে এটি monomeric অবস্থায় এসব সাইটে পৌঁছায়। ফল হলো neutral aqueous dye-এর তুলনায় ব্যাকটেরিয়ার দ্রুত ও বেশি তীব্র স্টেইনিং, যেখানে রুটিন ব্যাকটেরিওলজিক্যাল স্মিয়ারের পরিচিত গাঢ় নীল rods এবং cocci দেখা যায়। স্টেইনিং সময় সাধারণত এক থেকে তিন মিনিট, এরপর পানি দিয়ে ধোয়া হয়।
এর ক্লাসিক প্রয়োগ হলো Loeffler serum medium-এ বেড়ে ওঠা Corynebacterium diphtheriae: সরু, প্রায়ই clubbed rods, যাদের মধ্যে সঞ্চিত polyphosphate-এর Babes-Ernst granules দৃঢ়ভাবে metachromatic রঙ ধারণ করে। Medium ও stain-এর এই যুগল ঐতিহাসিকভাবে একই ব্যাকটেরিয়োলজিস্টের সঙ্গে যুক্ত, এবং granule contrast-ই এর মূল সুবিধা। ডিপথেরিয়া কাজের বাইরে এই স্টেইন সংস্কৃতি থেকে তৈরি স্মিয়ারের সাধারণ ব্যাকটেরিয়াল স্টেইন, clinical smear-এ Neisseria morphology এবং যেখানে Gram stain প্রয়োজন নেই কিন্তু সাধারণ aqueous blue খুব হালকা, সেসব ক্ষেত্রে ব্যবহৃত হয়। এটি একটি monochrome stain। সব অম্লীয় বস্তু কোনো না কোনো নীল আভা নেয়। যখন কোনো প্রোটোকল ভিন্ন রঙের পার্থক্য চায়, তখন শুধু ক্ষার তা দিতে পারে না।
একটি ব্যবহারিক সতর্কতা: ক্ষারীয় রঞ্জক দ্রবণ সংরক্ষণে এবং carbon dioxide গ্রহণে নষ্ট হয় ও অবক্ষেপ তৈরি করতে পারে। ল্যাবরেটরি হয় অল্প পরিমাণ প্রস্তুত করে, অথবা ক্যাটালগ দ্রবণ কিনে তার shelf life মেনে চলে, পুরনো বোতল ব্যবহার করে না যা প্রতিটি স্লাইডে অবক্ষেপ ফেলে।
Polychrome methylene blue: একটি নাম, একাধিক রঞ্জক
Polychrome methylene blue একই রঞ্জক থেকে শুরু হয়, কিন্তু ক্ষারের মধ্যে নিয়ন্ত্রিত অক্সিডেশনের মাধ্যমে প্রক্রিয়াজাত হয়, যা ঐতিহাসিকভাবে ripening বা polychroming নামে পরিচিত। ক্ষারীয় aging, carbonate দিয়ে উত্তাপ, অথবা dichromate-এর মতো অক্সিডাইজিং এজেন্ট ধাপে ধাপে dimethylamino substituent থেকে methyl group সরিয়ে দেয়। উৎপাদিত বস্তু একটি মিশ্রণ: অবশিষ্ট methylene blue-এর সঙ্গে azure B (একটি methyl হারানো), azure A এবং azure C (আরও demethylation), thionin (সম্পূর্ণ demethylated), এবং methylene violet পরিবারের oxidative side products। প্রতিটি উপাদানের নিজস্ব আভা ও টিস্যু-আকর্ষণ রয়েছে, তাই মিশ্রণটি metachromatically স্টেইন করে: নিউক্লিয়াস, granules, mucins এবং cartilage প্রত্যেকে আলাদা নীল থেকে লাল-বেগুনি রঙ গ্রহণ করে।
এই রসায়নই বিখ্যাত blood stain-এর পেছনের রসায়ন। প্রাথমিক গবেষকেরা দেখেছিলেন যে ক্ষারীয় methylene blue ম্যালেরিয়া পরজীবীর নিউক্লিয়াসকে বেগুনি আভায় স্টেইন করে, কিন্তু তাদের aqueous ripened দ্রবণ অস্থিতিশীল ছিল এবং কয়েক দিনের মধ্যে অবক্ষেপ তৈরি করত। how the purple blood stain was invented পর্যালোচনায় বর্ণনা করা হয়েছে কীভাবে Malachowski এবং Romanowsky 1891 সালে স্বাধীনভাবে এই প্রভাব ব্যবহার করেন, কীভাবে methanol রঞ্জক অবক্ষেপ স্থিতিশীল করতে এবং তাপ ছাড়াই film fix করতে ব্যবহৃত হয়, এবং কীভাবে পরে Giemsa glycerol stabilization সহ নির্ধারিত azure B ও eosin-এর অনুপাতে মিশ্রণকে মানসম্মত করেন। আধুনিক Giemsa-type stain সরাসরি polychrome methylene blue plus eosin থেকে এসেছে, যে সমন্বয় Romanowsky effect তৈরি করে। Eosin pairing এবং azure B component সম্পর্কে বিস্তারিতের জন্য দেখুন Romanowsky-type stains and the azure B eosin interaction।
যেহেতু এটি একটি মিশ্রণ, polychrome methylene blue প্রকৃতিগতভাবেই তিনটির মধ্যে সবচেয়ে কম standardized। এর নির্দিষ্ট রঙের ভারসাম্য oxidation route এবং মাত্রার ওপর নির্ভর করে, তাই histology supplier-রা এটিকে Loeffler's aged version হিসেবে নয়, বরং নিজস্ব performance testing সহ পৃথক পণ্য হিসেবে বিক্রি করে। সাধারণ ব্যবহার হলো mast cell granules, mucins এবং cartilage-এর metachromatic প্রদর্শন, plasma cell detail, এবং Goodpasture-type polychrome পদ্ধতিতে tissue section-এ Helicobacter pylori। রঙের মাধ্যমে পার্থক্য নির্ণয় করতে হলে এটি উপযুক্ত, কিন্তু যেখানে পরিষ্কার monochrome bacterial silhouette প্রত্যাশিত সেখানে এটি সঠিক পছন্দ নয়।
ফর্মুলেশন এবং উদ্দেশ্যের তুলনা
| Formulation | What is in the bottle | pH character | Staining principle | Use it when |
|---|---|---|---|---|
| Aqueous methylene blue (~1%) | পানিতে Methylene blue | প্রায় নিরপেক্ষ | একক ক্যাটায়নিক রঞ্জক নিউক্লিক অ্যাসিড এবং অম্লীয় প্রাচীর গ্রুপের সঙ্গে যুক্ত হয়; monochrome blue | রুটিন morphology, teaching smears, সাধারণ microscopy যেখানে contrast-এর চাহিদা মাঝারি |
| Loeffler's alkaline methylene blue (~0.3% dye plus dilute KOH) | অ্যালকোহলিক stock থেকে Methylene blue, dilute করা, এবং ~0.01% alkali | ক্ষারীয় | একই ক্যাটায়ন deprotonated acidic site-এ আরও শক্তভাবে যুক্ত হয়; দ্রুত ও বেশি তীব্র monochrome staining | সাধারণ bacteriology, granule contrast সহ diphtheria smears, neutral dye-তে দুর্বল জীব |
| Polychrome methylene blue | Oxidatively demethylated mixture: azure A, azure B, azure C, thionin, methylene violet, residual methylene blue | প্রস্তুতির সময় ক্ষারীয়; সরবরাহকৃত অবস্থায় mixture | একাধিক homologue-এর পৃথক affinity metachromatic, polychromatic hue তৈরি করে; eosin-এর সঙ্গে Romanowsky stain-এর ভিত্তি | Mast cells, mucins, tissue metachromasia, Giemsa-type derivative-এর মাধ্যমে blood ও parasite work |
টেবিলটিকে একটি সিদ্ধান্ত পদ্ধতি হিসেবে পড়ুন। যদি নমুনা খুব হালকা স্টেইন হয়, pH ধারণা পরিবর্তন করুন এবং Loeffler's ব্যবহার করুন। যদি সবকিছু স্টেইন হয় কিন্তু কিছুই আলাদা না হয়, dye ধারণা পরিবর্তন করুন এবং polychrome ব্যবহার করুন। যদি Loeffler smear-এ granules সুন্দর দেখা যায় কিন্তু supervisor জিজ্ঞেস করেন কেন nuclei এবং cytoplasm একই নীল, উত্তর হলো কোনো alkaline monochrome stain সেই কাজ করতে পারে না। এই প্রশ্নটি polychrome family এবং তার blood stain derivatives-এর অন্তর্গত।
প্রচলিত বিভ্রান্তি এড়ানো
বেশিরভাগ বিভ্রান্তির জন্য দুটি ভুল দায়ী। প্রথমটি হলো Loeffler's-কে সাধারণ methylene blue-এর সমতুল্য ভাবা, কারণ বোতলে দুটিই নীল দেখায়। এদের pH এবং তীব্রতা আলাদা, এবং যেখানে Loeffler's নির্দিষ্ট করা হয়েছে সেখানে neutral dye ব্যবহার করলে সেই granule contrast হারিয়ে যায় যার জন্য প্রোটোকল তৈরি করা হয়েছিল। দ্বিতীয়টি হলো যেকোনো পুরনো বা দুর্ঘটনাক্রমে aged alkaline blue-কে polychrome মনে করা। অনিয়ন্ত্রিত aging অজানা শক্তির অজানা মিশ্রণ তৈরি করে, যেখানে প্রকৃত polychrome solution নির্ধারিত oxidation route-এ প্রস্তুত করা হয় এবং blood stain lineage-এ পরিমিত eosin-এর সঙ্গে যুক্ত হয়। ইতিহাস এখানে শিক্ষণীয়: 1890-এর দশকের অস্থিতিশীল aqueous ripened solution-গুলো পরে methanolic stabilized formulation-এ পরিবর্তিত হয়েছিল, কারণ অনিয়ন্ত্রিত মিশ্রণ পুনরুৎপাদন করা যেত না; অনিশ্চিত বয়সের বোতল থেকে diagnostic slide স্টেইন করার আগে এই শিক্ষা মনে রাখা উচিত।
নামের নির্ভুলতা বিষয়টি সম্পূর্ণ করে। রঙ দেখে অনুমান না করে লেবেলে catalog item (aqueous বনাম Loeffler বনাম polychrome), dye content এবং উদ্দেশ্য নিশ্চিত করুন। তিনটি formulation-এর একটি chromophore ancestor একই। কিন্তু এদের উদ্দেশ্য একই নয়।