Статия
Тестът за редукция на метиленово синьо в мляко: принцип и ограничения
Студентка вдига две епруветки с мляко. Едната е побеляла за един час. Другата е останала синя пет часа. Тя посочва синята и казва, че млякото в нея е безопасно за пиене.
Този извод разкрива погрешна представа за теста. Тестът с метиленово синьо за мляко не установява безопасност. Той показва колко бързо микробната популация в епруветката понижава редокс потенциала при фиксирани условия. Бавният резултат означава ниска обща метаболитна активност в пробата. Той не показва кои микроорганизми присъстват, дали сред тях има патоген, нито дали млякото е пастьоризирано правилно.
Това разграничение е важно, защото тестът изглежда убедителен. Синият цвят изчезва. Часовникът дава число. Числата подтикват към прекомерно тълкуване. Тази статия запазва полезното тълкуване и изключва опасното.
Какво всъщност измерва редукцията
Метиленовото синьо е синьо в окислено състояние и почти безцветно, когато се редуцира до левкометиленово синьо. Прясното мляко съдържа разтворен кислород, който поддържа синия цвят на багрилото. Бактериите, които дишат и ферментират, изразходват този кислород и отделят редуциращи съединения. Когато редокс потенциалът спадне достатъчно, багрилото приема електрони и губи цвета си. Учебният текст по микробиология на млякото на Университета в Гуелф описва същата последователност: отстраняване на кислорода, последвано от образуване на редуциращи вещества при бактериалния метаболизъм.
Класическо изследване в Journal of Dairy Science представя това като двуетапен процес: първо микрофлората изчерпва кислорода, след което съставките на млякото бързо редуцират багрилото. Затова тестът за редукция на метиленово синьо в мляко е най-добре да се разглежда като функционален анализ на съвкупната метаболитна активност, а не като средство за преброяване на клетки. Редокс поведението на метиленовото синьо обяснява химията зад тази промяна.
Кислородът обръща промяната, по която се отчита крайната точка. Редуцираното левкобагрило, изложено на въздух, се окислява отново и пак става синьо. Затова разклащането, преливането, широките епруветки и големият въздушен обем над течността забавят резултата. На повърхността в контакт с въздуха често остава тънък син пръстен, след като основният обем в епруветката се е обезцветил. Стандартните процедури приемат наличието на този пръстен, вместо да изчакват изчезването му.
Видът на микроорганизмите внася второ изкривяване. Колиформите и много млечнокисели микроорганизми редуцират багрилото бързо. Много психротрофни и термоустойчиви микроорганизми го редуцират бавно или почти никак. Две проби мляко с еднакъв брой колонии при посявка могат да се обезцветят с часове разлика. Само този факт е достатъчен, за да се изключи преобразуването на времето в брой колонии.
Контролирана лабораторна процедура
Полевите и учебните варианти се различават в подробностите, затова един резултат е валиден само в рамките на метода, по който е получен. Обичаен вариант за лаборатория за анализ на храни протича така:
- Вземете проба от сурово мляко с минимално аериране и я охладете незабавно. Преди отделяне на пробата за анализ смесете чрез внимателно обръщане.
- Поставете 10 mL мляко в стерилна епруветка с 1 mL работен разтвор на багрилото. Една широко използвана работна концентрация е 0.005 процента багрило, при съотношение мляко към багрило 10 към 1.
- Затворете епруветката със запушалка, обърнете я внимателно два пъти и до няколко минути я поставете във водна баня. Обичайната температура на инкубация е от 35 до 38 градуса Целзий според конкретния стандарт. Запишете кой стандарт следвате.
- Пазете епруветките от светлина по време на инкубацията, тъй като светлината ускорява редукцията.
- Отчетете резултата на 30-ата минута, а след това през фиксирани интервали. Крайната точка е моментът, когато епруветката съответства на референтна проба с преварено мляко или достигне степента на обезцветяване, определена в процедурата.
- Запазете епруветка със същото мляко без добавено багрило като визуална контрола, когато методът изисква такава.
Ръководството на FAO за изпитване на мляко дава конкретен полеви вариант на тази последователност с 10 mL мляко плюс 1 mL багрило, затваряне със запушалка, внимателно обръщане, инкубация при около 37 до 38 градуса и отчитане на всеки 30 минути. В контролните епруветки се използва преварено мляко, за да се разруши естествената редуцираща система и да се осигури отправна точка за сравняване на цвета.
Горната схема очертава рамката на контролираните условия. Еднакви обеми, едно и също багрило, еднаква температура, еднакво смесване, еднаква защита от светлина, едно и също правило за крайната точка. Променете което и да е от тях и времето също се променя. Затова домашните варианти с произволна концентрация на багрилото не са съпоставими с лабораторните оценки.
Какво показва времето за редукция
По-дългото време означава по-ниска обща активност при посочените условия. По-краткото време означава по-висока обща активност. Учебните таблици за мляко свързват тези времена с приблизителни оценки — например 5 или повече часа като много добро качество и под 30 минути като лошо качество в една схема, основана на BIS.
Именно различията са поуката. Резултат от 5 часа няма универсална оценка. Той принадлежи на процедурата, която го е определила. Следователно обоснованият формат за докладване е:
MBRT е равно на X часа по посочения метод и съответства на оценката по този метод.
Никога не се докладва „MBRT е равно на X колониеобразуващи единици на mL“. Указанията, основани на Standard Methods, посочват, че резултатите от редукция на багрило не трябва да се докладват като брой бактерии. Процедурата за просто оцветяване с метиленово синьо също отговаря на друг въпрос, тъй като показва формата на клетките под микроскоп, а не общата активност в епруветка.
Таблица за тълкуване и ограничения
Тази таблица е оригиналната справочна таблица за статията. Четете всеки ред изцяло. Нито една клетка не трябва да се разглежда самостоятелно.
| Наблюдение или твърдение | Какво показва | Какво не може да докаже | Основни смущаващи фактори |
|---|---|---|---|
| Бързо изчезване на синия цвят, под 2 часа в една схема за сурово мляко | Висока редуцираща активност, съвместима с голямо микробно натоварване или ниска трайност | Видове, точен брой, токсини или неуспешна пастьоризация | Съхранение на топло, микрофлора с много колиформни бактерии, светлина, малко количество багрило |
| Междинно време, от 2 до 4 часа | Умерена активност; оценката е валидна само в рамките на посочената схема | Безопасност или отсъствие на бавно редуциращи микроорганизми | Висока температура на инкубация, разлики в аерирането, отделяне на мазнината |
| Бавна редукция, 5 или повече часа | Ниска обща активност в рамките на тази схема | Отсъствие на патогени, извършена пастьоризация или химична безопасност | Остатъци от антибиотици, консерванти, допълнителен разтворен кислород, голямо количество багрило |
| Син пръстен остава на повърхността, докато основният обем се обезцветява | Повторно окисление на границата с въздуха — нормален граничен ефект | Неуспешен тест или непълна реакция | Широка епруветка, недобре затворена запушалка, многократно отваряне за проверка |
| Бяла епруветка след инкубация на нагрято мляко | Променена редуцираща система плюс запазена микробна активност | Че нагряването е било равностойно на валидирана пастьоризация | Увреждане от топлината, възстановяване по време на инкубацията, последващо замърсяване |
| Каквато и да е единична стойност на MBRT, цитирана без метод | Неизвестни условия на изпитване | Каквато и да е оценка или брой | Не са посочени съставът на багрилото, съотношението, температурата, смесването и правилото за крайната точка |
Изследванията, основани на растеж, например върху хранителни среди за бактерии, остават подходът за преброяване и изолиране. Епруветката за редукция служи за скрининг. Посявката върху плака служи за идентифициране и преброяване.
Какво тестът не може да докаже за безопасността
Бавният резултат не може да докаже отсъствие на патогени. Патоген, присъстващ в клинично значимо количество, може да допринася съвсем малко за общото потребление на кислород. Откриването на патогени изисква методи, специфични за съответния микроорганизъм, които актуалното издание на Standard Methods разглежда отделно от общия скрининг за качество.
Тестът не може да потвърди пастьоризацията. Съгласно указанията на Codex за хигиена на млякото и млечните продукти проверката на топлинната обработка се извършва чрез тест за алкална фосфатаза или друг валидиран метод. Бялата или синята епруветка не показва нищо за времево-температурната история на партидата.
Тестът не може да удостовери безопасността на храната. Безопасността зависи от патогените, вече образуваните токсини, остатъците от лекарствени вещества, химичните замърсители, историята на хладилната верига и замърсяването след вземане на пробата. Codex разглежда безопасността на млякото и млечните продукти като верига от контролни мерки, а не като единичен скринингов резултат.
Условията в лаборатория за анализ на храни не са домашно тестване
В лаборатория за мляко и млечни продукти тестът служи за скрининг на постъпващото мляко, за сравняване на доставчици във времето или за обучение по редокс микробиология под надзор. Пробите са проследими. Реактивите са стандартизирани. Температурите се записват. Отпадъците се обезвреждат по лабораторните процедури.
При домашното тестване нищо от това не е налице. Обемите, измерени в кухнята, са приблизителни. Концентрациите на багрилата, продавани онлайн, се различават значително. Инкубацията често се извършва в топла стая, а не в калибрирана водна баня. Промяната в цвета все пак настъпва и създава усещане за надежден резултат, въпреки че липсват всички контролирани условия, които му придават смисъл.
По-сериозният риск е свързан с поведението. Синята епруветка у дома подтиква към пиене на сурово мляко, което една лаборатория все пак би подложила на преброяване чрез посявки, скрининг за патогени и проверки за остатъчни вещества. Тестът с метиленово синьо за мляко е създаден за оценка на суровото мляко при приемане, а не за разрешаване на консумацията му. По-бързият скрининг с резазурин има същото ограничение: по-бързо отчитане на цвета, но отново без отговор за наличието на патогени.
Кратко правило за лабораторната маса
Стандартизирайте багрилото, съотношението, температурата, смесването, светлината и крайната точка. Докладвайте времето заедно с името на метода и оценката. Тълкувайте минутите във връзка с историята на съхранение, вида на микрофлората, остатъчните вещества и качеството на вземане на пробата. Краткото време сигнализира за активност, която си струва да бъде изследвана. Дългото време никога не удостоверява безопасност.