Редукционен тест с метиленово синьо за търбухова течност

Наскоро дипломирана специалистка се обажда от ферма със синя епруветка в ръка. Преди десет минути е добавила метиленово синьо към търбухова течност, но синият цвят още не е изчезнал. Пита дали трябва да даде още багрило на кравата.

Този въпрос разкрива погрешна представа. При редукционния тест с метиленово синьо за търбухова течност багрилото се добавя в епруветката, никога в животното. Цялото изследване се провежда в епруветката. Измерването на скоростта, с която синият цвят изчезва, дава информация за микробите в тази проба, а не за лечение, от което животното се нуждае.

Объркването е разбираемо, защото метиленовото синьо се използва в три различни ветеринарни контекста. Тази статия ги разграничава и показва как времето на редукция се тълкува заедно с pH, протозоите, качеството на пробовземането и клиничните признаци.

Какво всъщност измерва тестът

Метиленовото синьо е синьо в окислено състояние и почти безцветно в редуцирано състояние. Прясната търбухова течност от здраво животно има силно редуциращи свойства, защото анаеробните бактерии активно ферментират фуража. Когато към такава течност се добави малко количество багрило, бактериалният метаболизъм премахва цвета за няколко минути.

Следователно принципът на действие е прост: активната анаеробна микрофлора обезцветява багрилото бързо, а неактивната или увредената — бавно. Краткото време означава по-голям редукционен капацитет в тази проба. Удълженото време насочва към потисната микробна активност, при условие че пробата е взета и обработена правилно.

Тестът не измерва пряко окислително-редукционния потенциал на търбуха. Проучване на методи при говеда, което сравнява редукционния тест с директни измервания в миливолтове, не установява линейна корелация между времето на редукция и измерения окислително-редукционен потенциал. Заключението е, че двата показателя не бива да се приемат за взаимозаменяеми измервания на една и съща величина. Пълното сравнение е обобщено в PubMed. Приемайте редукционния тест като функционално изследване на микробната популация, а не като евтин заместител на електрод.

Описанието на простото лошо храносмилане при преживните животни в Merck/MSD разглежда удълженото време на редукция като част от същата картина, която включва отклонения в pH на търбуха и намален брой протозои. Нито една отделна стойност не определя диагнозата. Определя я съвкупността от находки.

Стандартна процедура на място

Протоколите се различават леко между учебните школи, затова записвайте точните обеми и температурата, които използвате, и сравнявайте резултатите само в рамките на същия протокол. Един широко преподаван вариант е:

Вземете поне 10 до 20 mL прясна търбухова течност с минимално примесване на слюнка, излагане на въздух и охлаждане. Изследвайте незабавно.
Пригответе 0.03 процента метиленово синьо, което съответства на 0.3 mg на mL.
Добавете багрило в количество 5 процента от обема на течността. Това означава 1.0 mL багрило към 20 mL течност или 0.5 mL багрило към 10 mL течност. И в двата случая съотношението течност към багрило е 20 към 1.
Запазете втора епруветка с необработена течност от същата проба като цветна контрола.
Разбъркайте внимателно, включете таймера веднага и поддържайте епруветката близо до телесната температура, около 37 до 39 градуса Целзий според местния протокол.
Запишете времето, за което цветът в тестовата епруветка се изравнява с този на контролата. На повърхността в контакт с въздуха може да остане тънък син пръстен, защото там кислородът отново окислява багрилото. Не чакайте този пръстен да изчезне.

Окислително-редукционната химия на метиленовото синьо обяснява защо кислородът е важен тук. Енергичното разклащане, широко отворената епруветка или продължителното забавяне позволяват навлизане на кислород и задържат багрилото синьо по-дълго, отколкото би се случило в самия търбух. Подробностите за техниката на вземане на търбухова течност без замърсяване са важни по същата причина. Слюнката разрежда пробата и повишава pH, затова при използване на стомашна сонда много клиницисти изхвърлят първата порция, когато обемът позволява.

Какво измерват различните наблюдения

Времето на редукция отговаря само на един въпрос. Оценката на търбуха по-долу показва какво допринася всяко наблюдение на място. Използвайте целия ред, а не една клетка.

Наблюдение	Какво измерва	Типична находка на място	Чести объркващи фактори
Време на редукция на метиленовото синьо	Функционална редуцираща активност на анаеробните бактерии в пробата	При говеда често 2 до 6 минути; при овце и кози често по-бързо, като 6 минути се използват като практически праг за достатъчна активност, а времена над 10 минути са силно отклонени от нормата	Студена, забавено изследвана, аерирана или разредена със слюнка проба; малко субстрат след продължителна анорексия; перорални антимикробни средства; сравнение при различни съотношения на багрилото или температури
pH на търбуха	Химична среда, киселинно или алкално натоварване	При говеда, хранени с груб фураж, често около 6.0 до 7.2; в учебниците за дребни преживни животни често се посочва около 6.5 до 7.5; хранителният режим и времето след хранене променят стойността	Примесването на слюнка повишава pH в проби, взети със стомашна сонда; загуба на въглероден диоксид след вземането; храненето със зърно понижава pH
Брой и подвижност на протозоите	Запазеност на популацията от инфузории, особено на големите форми, чувствителни към нарушения	Много организми с различни размери и активно насочено движение в топла прясна капка	Охлаждането забавя движението; тежката ацидоза може да унищожи протозоите; забавянето прави нормалната проба да изглежда слабо активна
Мирис, цвят и консистенция	Характер на ферментацията и замърсяване	Леко ароматна, зеленикавокафява, слабо вискозна течност	Гнилостен или кисел мирис при тежка дисбиоза; водниста течност или течност с много слюнка след неправилно пробовземане
Съкращения на търбуха и апетит	Функция на предстомашията и прием на храна на ниво цяло животно	Редовни съкращения и равномерно преживяне при жизнено животно	Скорошна промяна на дажбата, болка, обезводняване, системно заболяване

Основният извод е в таблицата. Удължено време на редукция заедно със слабо подвижни протозои, отклонено pH и слаби съкращения насочва към действително потисната микробна активност. Изолирано удължено време при жизнено, преживящо животно с активно подвижни протозои насочва към проблем с пробата, а не с търбуха. Повторете пробовземането, преди да предприемете действия.

Тълкуване на времето заедно с pH и анамнезата

Хранителният режим определя изходното ниво. Дажбите, богати на концентрати, ферментират бързо и могат да обезцветят багрилото за около минута, докато при хранене със сено може да са необходими няколко минути дори при здрави животни. Следователно краткото време само по себе си не доказва по-добро здраве. То показва, че повече ферментируем субстрат е попаднал в контакт с активни микроби.

Тежкото претоварване със зърно нарушава тази проста зависимост. В началото ферментацията на въглехидратите може да е интензивна, след което киселинното увреждане потиска нормалната микрофлора и протозоите и редукцията се удължава. Затова едно от преподаваните правила гласи, че тестът не е валиден, когато pH на търбуха е под около 5.5. В този момент изследваната микрофлора вече е променена.

Практически насоки за разпознаване на съчетанията:

Нормално pH с редукция в рамките на около 6 минути предполага функционално активна микрофлора.
Нормално pH със силно удължена редукция предполага неактивност вследствие на анорексия, действие на антимикробни средства или компрометирана проба.
Високо pH с удължена редукция често следва продължителна анорексия с малко наличен субстрат, но трябва да се отчете и примесването на слюнка при използване на сонда.
Ниско pH с намалена активност на протозоите поражда съмнение за дисбиоза, свързана с въглехидратите. Насоките за тълкуване на pH на търбуха са полезни тук. Стойности под 5.5 с общо потиснато състояние насочват не към просто лошо храносмилане, а към претоварване със зърно и тежка ацидоза.

Винаги записвайте скорошния прием на перорални тетрациклини, йонофори във фуража, продължително прилагани системни антимикробни средства, резки промени в дажбата, продължителността на анорексията и приема на вода. Ръководството MSD изрично предупреждава, че пероралните тетрациклини могат значително да потиснат търбуховата микрофлора. Йонофорите целенасочено променят бактериалните популации. Без тази анамнеза удълженото време не може да се тълкува.

Качеството на пробовземането заслужава същото внимание. Контролирано изследване установява по-високо pH и по-ниски нива на летливи мастни киселини в пробите, взети със стомашна сонда, спрямо пробите, взети през канюла от същите животни, главно поради слюнката. До 60 минути след вземането времето на редукция се удължава значително при всеки изследван обем, като малките проби са най-засегнати. Вземете поне 10 mL, изследвайте в рамките на 30 минути, извършете редукционния тест в началото, поддържайте пробата топла и сведете контакта с въздуха до минимум.

Три приложения, които не бива да се бъркат

Едно и също багрило, три различни системи.

Първо, описаното тук изследване на търбухова течност. Материалът е взета търбухова течност. Багрилото се добавя in vitro при 0.03 процента. Крайният показател е времето до обезцветяване. Целта е оценка на микробната редуцираща активност.

Второ, метиленово синьо, приложено на живо преживно животно. Утвърденият пример е интравенозната терапия при нитратна или нитритна токсикоза с метхемоглобинемия, при която лекарството възстановява функционалния хемоглобин. Прилагат се правила за дозата, лекарствената форма, остатъчните количества и карентните срокове. Това решение няма нищо общо с измерването на времето в епруветка. Ако багрилото се използва като маркер in vivo при конкретна процедура, принципът е да се проследи къде се придвижва то, а не колко бързо търбуховите микроби го редуцират.

Трето, редукционният тест за мляко. Материалът е мляко. Багрилото се добавя към млечната проба. Бързото изчезване на синия цвят обикновено показва по-голяма микробна активност и по-лоша съхраняемост, докато бавната редукция показва по-добро качество. Тестът принадлежи към микробиологията на храните и изследването на качеството на млякото, а не към диагностиката на търбуха, и не представлява преброяване на бактерии.

Използването на ясни наименования предотвратява грешките: време на редукция в търбухова течност, системна терапия с метиленово синьо или употребата му като маркер и редукционен тест за мляко. Правилото за безопасност се побира в едно изречение. Багрилото за изследването на търбухова течност остава в лабораторната епруветка, а епруветката се изхвърля. То никога не се прилага на животното за провеждане на теста.

Кратко правило за посещението във фермата

Стандартизирайте багрилото на 0.03 процента и съотношение 1 част багрило към 20 части течност, изследвайте прясна течност близо до телесната температура спрямо необработена контрола и тълкувайте минутите заедно с pH, подвижността на протозоите, качеството на пробовземането, хранителния режим, лекарствата, съкращенията, апетита, изпражненията и хидратацията. Изолирана стойност никога не поставя диагноза лошо храносмилане. Съгласуваната съвкупност от находки го прави.