Статия
Разчитане на външния вид на колонии на E. coli и други микроорганизми върху EMB агар
Студент посява непознат микроорганизъм чрез щриховане върху агар с еозин и метиленово синьо, инкубира го през нощта и на следващия ден вижда плака с тъмни колонии със зелен отблясък. В лабораторния дневник записва „E. coli, потвърдена“. Този запис твърди повече, отколкото плаката може да докаже. Плаката показва фенотип на растеж и ферментация при конкретни условия. Видовата идентичност е отделно заключение, което изисква отделни доказателства.
Това ръководство разглежда резултатите от EMB агар като задача за интерпретация. То обяснява основния принцип, представя илюстративен атлас на плаки с контроли и посочва случаите, в които описаният в учебниците вид е подвеждащ.
Принципът зад плаката
EMB агарът е едновременно селективен и диференциален. Багрилата еозин Y и метиленово синьо потискат много грам-положителни микроорганизми, така че средата благоприятства растежа на грам-отрицателни микроорганизми. Същите багрила действат и като индикатори: когато микроорганизмът ферментира наличната захар и образува достатъчно киселина локално, колонията поема интензивно багрилата и става тъмновиолетова до синьо-черна. При интензивно образуване на киселина повърхността на колонията може да прояви металнозелен иридесцентен блясък. Протоколът на ASM за плаки с агар с еозин и метиленово синьо описва тази комбинация от селекция и диференциация и предоставя референтни снимки за учебни цели.
Преди разчитането на какъвто и да е резултат е важна една подробност: проверете коя формула на средата се използва. По-старата формула Holt Harris Teague съдържа лактоза и захароза, докато Levine EMB съдържа само лактоза. Микроорганизъм, който ферментира захароза, но не и лактоза, като много изолати на Serratia marcescens, може да изглежда различно върху двата варианта. Документацията на производителя за EMB среди изрично посочва тази разлика във формулите. Запишете производителя и формулата в дневника заедно с резултата.
Приготвеният непосят EMB агар обикновено е червено-кафяв до червеникаво-виолетов, понякога със зеленикав оттенък или фина утайка. Този фонов цвят не е растеж. Сравнявайте всяко разчитане с непосята плака или с документирания изходен вид и разчитайте първичната плака след около 18 до 24 часа аеробна инкубация при 35 до 37 C, освен ако учебният протокол не предписва друго. Продължителната инкубация може да промени видимите признаци на ферментацията.
Как да оглеждате плаката
Използвайте два вида осветление. Първо огледайте плаката при отразена или косо падаща светлина и я наклонете: металният блясък е иридесцентен и може да се появява или изчезва според ъгъла на наблюдение. След това я разгледайте при преминаваща светлина, за да оцените цвета на колониите и тъмните им центрове. Работете с добре изолирани колонии, тъй като плътният растеж и съседните колонии променят локалното натрупване на киселина и могат да отслабят или засилят оцветяването. Колекцията от изображения на ASM показва това пряко: E. coli в смесена култура може да загуби очаквания си блясък, защото околните микроорганизми променят киселинността на средата.
Включвайте контроли, когато упражнението го позволява. Обичаен учебен набор е E. coli ATCC 25922 за фенотипа със синьо-черно оцветяване и метален блясък, неферментиращ микроорганизъм като Salmonella Typhimurium ATCC 14028 или Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 за безцветния фенотип и грам-положителен микроорганизъм като Enterococcus faecalis или Staphylococcus aureus като контрола за инхибиране, както е посочено в стандартните таблици за контрол на качеството на EMB среди. Ако положителната контрола няма блясък, първо потърсете причината в инкубацията, плътния растеж или формулата на средата, преди да я търсите в непознатия микроорганизъм.
Илюстративен атлас на плаките
Плаките по-долу са генерирани илюстрации, а не снимки на реални култури. Те показват характерните признаци, които да търсите, а не точния оттенък на конкретен щам. Сравнявайте ги с референтните снимки на ASM и с реални плаки от учебната лаборатория.
Плака 1: Escherichia coli върху EMB агар, интензивно ферментираща лактозата
E. coli върху EMB агар обикновено е тъмновиолетова до синьо-черна, често с тъмен център и металнозелен блясък вследствие на интензивното образуване на киселина. Блясъкът е добре познатият признак, който студентите търсят, но го приемайте като подкрепящо доказателство, а не като определящ белег. Интензивността на блясъка варира според щама, времето на инкубация, плътността на колониите и ъгъла на наблюдение. Липсата на блясък не изключва E. coli, а тъмна колония без блясък насочва и към няколко други ферментиращи микроорганизми. За всяка последваща работа избирайте добре изолирана колония, вместо да разчитате участък с плътен растеж.
Плака 2: Klebsiella pneumoniae върху EMB агар, мукоиден ферментиращ микроорганизъм
Klebsiella pneumoniae върху EMB агар обикновено образува големи, лъскави, мукоидни колонии в розово-виолетови до кафяво-виолетови нюанси, често с тъмни центрове, но обикновено без силен метален блясък. Подобна морфология се среща при сродни ферментиращи микроорганизми като Enterobacter. Мукоидната консистенция и размерът на колонията са част от разчитането: малка и плоска розова колония има различна интерпретативна тежест от голяма, изпъкнала мукоидна колония. Както при E. coli, плаката насочва към ферментационен фенотип, а определянето на вида изисква биохимично потвърждение, описано по-долу.
Плака 3: Salmonella върху EMB агар и други неферментиращи микроорганизми, безцветни колонии
Salmonella върху EMB агар и сродни микроорганизми, които не ферментират лактоза, включително Shigella и много изолати на Pseudomonas, обикновено растат като безцветни до полупрозрачни или бледокехлибарени колонии. Някои формули и условия придават слаб розов оттенък, така че бледорозовата колония не означава автоматично ферментиращ микроорганизъм. EMB не разграничава Salmonella от Shigella или от други неферментиращи микроорганизми; това разграничение се прави с последващи тестове. Имайте предвид също, че са документирани лактозо-положителни щамове на Salmonella с метално блестящи колонии, подобни на тези на E. coli — още една причина една-единствена плака да не е достатъчна за окончателно заключение.
Плака 4: Serratia marcescens и капанът на формулата на средата
Serratia marcescens заслужава отделен раздел, защото студентите често очакват червени колонии и след това разчитат плаката погрешно. Повечето клинични изолати не ферментират лактоза, затова върху Levine EMB обикновено изглеждат бледи до слабо оцветени. Тъй като много изолати ферментират захароза, формула, съдържаща захароза, може да даде по-тъмна или по-изразена реакция, свързана с образуването на киселина. Не очаквайте и класическия червен пигмент продигиозин при 35 до 37 C; образуването на пигмент не е надежден признак при температурата в инкубатора. Когато протоколът посочва Serratia marcescens върху EMB агар, проверете коя формула се подразбира в твърдението. Обзор на метаболизма на Serratia обобщава модела на отрицателна ферментация на лактоза и вариабилна ферментация на захароза, който стои зад този капан.
Плака 5: контроли и инхибирани микроорганизми
Грам-положителни микроорганизми като Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus и Bacillus обикновено са инхибирани или растежът им е значително потиснат върху EMB агар, макар че инхибирането не е абсолютно за всеки щам. Наборът от контроли прави разчитането обосновано: контролата с E. coli трябва да показва добър растеж със синьо-черно оцветяване и блясък, контролата с неферментиращ микроорганизъм трябва да показва безцветен растеж, а контролата за инхибиране трябва да показва слаб или никакъв растеж. Ако контролата за инхибиране расте добре, селекцията е неуспешна и всяко друго разчитане върху тази партида е съмнително. Методите за оцветяване отговарят на различен въпрос от хранителните среди; за оцветяването на микроскопски препарати в лабораторията вижте атласа на оцветяването с метиленово синьо.
Сравнение с ясни граници
| Наблюдение върху EMB агар | Вероятно значение | Какво не доказва |
|---|---|---|
| Тъмна синьо-черна колония със зелен блясък при косо падаща светлина | Интензивна ферментация, E. coli е водеща възможност | Видова идентичност; други интензивно ферментиращи микроорганизми също могат да имат блясък |
| Голяма мукоидна розово-виолетова колония, без блясък | Ферментиращ микроорганизъм с капсулни признаци, Klebsiella е възможност | Конкретно Klebsiella pneumoniae; Enterobacter изглежда подобно |
| Безцветна или полупрозрачна колония | Микроорганизъм, който не ферментира лактоза, например Salmonella, Shigella, Pseudomonas | Кой е неферментиращият микроорганизъм; разграничаването на Salmonella от Shigella изисква други тестове |
| Бледа колония там, където се очаква червена | Възможно е да е Serratia върху EMB само с лактоза при 37 C | Отсъствие на Serratia; проверете формулата и температурата |
| Липса на растеж или дребни колонии с потиснат растеж | Възможно инхибиране на грам-положителни микроорганизми | Стерилност или идентичност; някои щамове избягват инхибирането |
Три изречения обобщават подвеждащите външни признаци. Тъмното оцветяване не означава E. coli, защото Klebsiella, Enterobacter и други ферментиращи микроорганизми развиват тъмни центрове без блясък. Розовото оцветяване не означава Klebsiella, защото умерено или бавно ферментиращи микроорганизми и някои обичайно определяни като неферментиращи изглеждат розови или светловиолетови. Блясъкът не означава окончателно установена E. coli, защото други интензивно ферментиращи микроорганизми също могат да го образуват. Учебният протокол и изображенията на смесени култури в него илюстрират всяка от тези погрешни интерпретации.
Граници на потвърждението
EMB агарът показва фенотип, а не вид. Различни микроорганизми могат да имат колонии с един и същ външен вид, а един микроорганизъм може да се отклонява от описания в учебниците вид според щама, възрастта на културата, плътността на растежа, формулата на средата и инкубацията. Затова в учебните и клиничните работни процеси морфологията върху EMB се приема като предварителна индикация.
Обоснован работен процес за студенти е следният: опишете изолираната колония (размер, цвят, център, блясък при косо падаща светлина, мукоиден характер), запишете формулата на средата, времето и температурата на инкубация и контролите; след това препосейте добре изолирана колония до получаване на чиста култура преди всеки потвърдителен тест. Обичайните последващи изследвания включват оцветяване по Грам и реакции IMViC за предварителна идентификация на E. coli и колиформни бактерии, TSI или KIA и специфични за микроорганизма биохимични панели за чревни микроорганизми, със серологична идентификация, MALDI TOF или друга валидирана идентификация, когато задачата го изисква. За обща информация относно мястото на EMB сред селективните и диференциалните среди за чревни микроорганизми вижте въведенията в хранителните среди за чревни микроорганизми и последващото оцветяване по Грам. По свързания въпрос какво може и какво не може да докаже синьото оцветяване на микроскопски препарат атласът на оцветяването с метиленово синьо също ясно разграничава наблюдението от заключението.
Запишете наблюдението преди заключението. „Тъмни синьо-черни колонии със зелен блясък, зависещ от ъгъла на наблюдение, върху Levine EMB след 24 часа, съответстващи на интензивна ферментация на лактоза“ е обосновано описание. „E. coli, потвърдена“ изисква потвърдителната стъпка, която плаката сама по себе си не може да осигури.