Тестове с метиленово синьо при дрожди: броене на живи клетки срещу измерване на времето за дишане

На лабораторната маса стоят две епруветки. И двете са сини. В едната сините клетки под микроскоп означават мъртви дрожди. В другата преминаването от синьо към безцветно означава, че дрождите са живи и дишат. Едно и също багрило, противоположни интерпретации. Объркате ли двата теста, всеки извод се обръща.

Това разграничение е същността на статията. Метиленовото синьо е окислително-редукционно багрило: в окислена форма е синьо, а в редуцирана форма е безцветно левкометиленово синьо. Броенето за оценка на жизнеспособността използва тази химия за кратко микроскопско наблюдение. Експериментът с дишането я използва в реакция в целия обем, проследявана във времето. Всеки тест изисква собствен протокол, собствени контроли и собствена доза скептицизъм.

Броене за оценка на жизнеспособността: кратко оцветяване и незабавно отчитане

Протоколът, използван в пивоварството, е най-стандартизираният вариант. Пригответе 0.01% w/v метиленово синьо в 2% натриев цитрат, смесете го 1:1 със суспензията от дрожди и изследвайте сместа след кратък фиксиран интервал. Публикуваните интервали варират от 1 до 2 минути в наръчника на Brewing Science Institute до около 5 минути в изследователски протоколи, а методът на OIV за микробиология на виното изисква изследване в рамките на 10 минути. Крайната концентрация на багрилото в сместа за броене е около 0.005%. Заредете подобрена камера на Neubauer и при увеличение около 400x класифицирайте тъмносините клетки като нежизнеспособни, а неоцветените като жизнеспособни. В метода на OIV светлосините клетки се отчитат като живи, което вече подсказва проблема със субективността, разгледан по-долу.

Концентрацията на клетките се определя от геометрията на камерата. Когато се брои целият централен квадрат със страна 1 mm, броят клетки на mL е равен на N по фактора на разреждане по 10^4, където N е броят в тази площ, както е описано в методите на ASBC за дрожди. Жизнеспособността се изчислява по-просто: неоцветените клетки, разделени на общия брой клетки, по 100. За оценка на жизнеспособността пребройте около 400 клетки, съгласно сравнителното проучване на FEMS в пивоварството и практиката на OIV. Прилагайте последователно едно правило за границите, например включвайте клетките върху долните и левите линии на мрежата и изключвайте тези върху горните и десните.

За пъпките е необходимо правило, преди броенето да започне. Според често използвана конвенция пъпката се брои като отделна клетка, когато достигне около половината от размера на майчината клетка, а под този размер се брои заедно с нея. Каквото и правило да изберете, прилагайте го във всеки квадрат и го запишете в работния лист, за да може следващият човек да го повтори.

Работен лист за броене (разпечатайте го)

Този работен лист е оригинален материал за статията. Препишете го в тетрадка или разпечатайте по един за всяка проба.

Жизнеспособност (%) = 100 x неоцветени / (неоцветени + тъмносини). Общ брой клетки на mL = N x фактор на разреждане x 10^4, като N е броят в определената площ на камерата. Запишете интервала на оцветяване до резултата, защото стойност за жизнеспособност без времето на отчитане не е възпроизводима.

Защо стойностите за жизнеспособност се променят

Времето е първият смущаващ фактор и влияе в две посоки. Метаболитно активните клетки редуцират багрилото, затова ранното отчитане може да улови живи клетки, преди да са завършили редукцията, и погрешно да ги класифицира като мъртви. Но продължителното излагане само по себе си е токсично и води до действително увредени сини клетки, създавайки фалшиво оцветяване за клетъчна смърт. Затова един учебен лабораторен протокол изисква отчитане в рамките на 5 минути, както е документирано в учебния протокол за дрожди на Wisconsin. Коректната формулировка е, че отчитането с метиленово синьо зависи от времето, затова изберете един кратък интервал и го поддържайте постоянен за всяка проба в серията.

Пробите с ниска жизнеспособност носят второ систематично отклонение. Стандартизираният метод предупреждава, че метиленовото синьо може да надцени действителната жизнеспособност под около 80%, защото клетките, които все още редуцират багрилото, не непременно запазват способността си да се размножават. Пивоварната литература описва същата ненадеждност, когато жизнеспособността е значително понижена. Приемайте метиленовото синьо като средство за бърза приблизителна оценка и потвърждавайте критичните решения при ниска жизнеспособност, например повторно използване на култура за засяване, чрез броене на колонии върху хранителна среда или допълващо оцветяване.

Влиянието на матрицата е на трето място. Методът на OIV се провежда при pH около 4.6 и предупреждава, че силно буферираните проби с ниско pH възпрепятстват правилното поведение на багрилото, като същевременно не препоръчва теста при съдържание на захар над 100 g/L, когато клетките изглеждат подвеждащо светлосини. Експериментално сравнение на pH при оцветяване установява съществено различна чувствителност в изследвания диапазон, в съответствие с проучване на зависимостта на метода с метиленово синьо от pH. Остатъчните частици са отделен капан: оцветените частици в нечисти пивоварни каши наподобяват мъртви клетки и увеличават разликите между операторите.

Тази вариабилност е количествено измерена, а не просто наблюдение. В шестмесечно пивоварно изпитване, описано в сравнителното проучване на FEMS за дрожди, измерванията с метиленово синьо в два повторения имат средно стандартно отклонение 6.1% спрямо 0.2% при поточна цитометрия с оксонол, като резултатите на двама оператори за една и съща проба се различават с до 13 процентни пункта. Количествено сравнение на методите за жизнеспособност от 2023 г. установява значително по-висока прецизност на флуоресцентната микроскопия и поточната цитометрия, като показва, че характеристиките на методите зависят от вида и матрицата. Класическото описание на метода от Painting и Kirsop (PMID 24430080) остава отправната точка, а по-широк обзор на тестовете за жизнеспособност и жизненост на дрождите (PMID 25154541) поставя метиленовото синьо сред допълващите, а не окончателните тестове. Трипановото синьо не е автоматично по-добрият избор тук: то отчита загубата на мембранна цялост, докато метиленовото синьо отчита поемането на багрилото и редуциращата активност, затова клетките под стрес могат да бъдат класифицирани различно с двете багрила.

Експериментът с дишането: измерете времето до изчезване на синьото

Вторият тест изобщо не използва микроскоп. Дрожди, глюкоза и разредено метиленово синьо се поставят в затворена епруветка, а часовникът измерва колко време е необходимо синьото да изчезне. В хода на метаболизма клетките генерират редуциращи еквиваленти, които превръщат синьото багрило в безцветната му форма, докато разтвореният кислород го окислява обратно. След като клетките понижат съдържанието на кислород, редукцията взема превес и епруветката се обезцветява. Следователно крайната точка отразява баланса между дишането, концентрацията на багрилото и наличието на кислород и трябва да се отчита като време за редукция или обезцветяване на метиленовото синьо, а не като пряка скорост на консумация на молекулен кислород.

Използвайте много по-разредено багрило, отколкото при оценката на жизнеспособността, за да получите удобно за измерване време. Наръчникът на AQA за задължителните практически занятия на ниво A level стандартизира това добре: 1 g глюкоза на 100 mL вода, затоплена до около 30 C, 5 g сухи дрожди, добавени непосредствено преди употреба, и работен разтвор на багрилото с концентрация около 0.001%, приготвен чрез разреждане на 0.1 mL от 1% изходен разтвор до 100 mL. Смесете 2 mL суспензия от дрожди и глюкоза с 2 mL работен разтвор на багрилото, оставете да се изравни с температурата на теста, разклатете веднъж за 10 секунди, пуснете таймера и не разклащайте отново. Разклащането въвежда отново кислород и връща синия цвят в епруветката — това е най-големият процедурен артефакт. AQA отбелязва, че сместа обичайно трябва да се обезцвети в рамките на около 5 минути при 35 C, със средни времена от изпитванията 275 s при 20 C, 128 s при 35 C и 145 s при 45 C. Това са примери от една постановка, а не универсални ориентири. Количествената връзка между скоростта на редукция и метаболитно активните дрожди при контролирани условия се подкрепя от специализирани проучвания на редукцията, включително публикацията, индексирана като PMID 25773544, и механистичното проучване в Yeast (2014).

Демонстрация на хода във времето (оригинален материал)

Таблицата по-долу е оригинална демонстрация, създадена за тази статия с описаната по-горе постановка по модела на AQA: 2 mL смес от дрожди и глюкоза плюс 2 mL работен разтвор на багрилото с концентрация около 0.001%, едно разклащане за 10 секунди, след което инкубиране без разклащане. Записите са примерни показания във формата, който една учебна група трябва да използва, като индексът на скоростта е определен като 1, разделено на времето за обезцветяване в секунди. Проведете опита със същите епруветки и заменете тези записи с измерените стойности.

Начертайте индекса на скоростта спрямо температурата за епруветки A, B и C. Кривата се издига, след което се изравнява или спада — това е очакваният модел за процес, управляван от ензими, а не права линия. Епруветки D, E и F не са точки от данните по тази крива. Те са контролите, които позволяват тя да бъде интерпретирана.

Контроли, които правят всеки тест смислен

Всяка серия за дишане се нуждае от три съпътстващи контроли. Дрожди, подложени на кипене или убити, плюс глюкоза и багрило трябва да останат сини, което доказва, че бързата редукция зависи от метаболизма на живите клетки. Живи дрожди плюс багрило без добавена глюкоза представляват субстратна контрола, но все пак очаквайте бавно обезцветяване, тъй като дрождите използват вътрешните си запаси. Глюкоза плюс багрило без дрожди е химичната празна проба, която е съществена, защото глюкозата в алкална среда може да редуцира метиленовото синьо без наличие на клетки.

Броенето за жизнеспособност се нуждае от друг вид контрол: постоянство на процедурата. Един и същ изходен разтвор на багрилото, едно и също съотношение на смесване, един и същ интервал на оцветяване, една и съща площ на камерата, едни и същи правила за пъпките и границите, с броене без информация за пробата, когато е възможно. Когато резултатите на двама оператори се различават с десет процентни пункта, работният лист обикновено разкрива причината: различно време, различен праг за синьото или различни правила за пъпките. Техниките за подготовка и наблюдение на оцветени клетки са свързани с методите за просто оцветяване на бактерии, а по-широк преглед на това какво маркира багрилото в различни образци е представен в атласа на микроскопското оцветяване. За физиката зад количественото отчитане на интензитета на синьото справочният материал за абсорбцията с обозначени условия обяснява защо всеки коефициент трябва да бъде придружен от условията за разтворителя, pH и концентрацията.

Изберете теста според въпроса. Колко клетки са живи в момента е въпрос на броене, на който се отговаря с микроскоп и работен лист. Колко активно диша тази култура е кинетичен въпрос, на който се отговаря с хронометър и епруветки при контролирани условия. Метиленовото синьо служи и за двете, но никога в една и съща епруветка по едно и също време.