Метиленово синьо и прогерия: изводи от клетъчен модел на стареене

Промяна на една буква в един ген кара децата да стареят с ужасяваща скорост. Косопад, сковани стави, стеснени артерии и очаквана продължителност на живота до тийнейджърска възраст. Това заболяване е синдромът на прогерия на Хътчинсън–Гилфорд и години наред изследванията му се съсредоточават върху ядрото, където мутантният белтък причинява увреждания. Проучване от 2016 г. на Университета на Мериленд задава различен въпрос: как изглеждат митохондриите в тези клетки? Отговорът свързва два клетъчни компартмента, а синьо багрило, познато от век, повлиява и двата.

Проучването е на Xiong и колеги, публикувано в Aging Cell през 2016 г.. То е проведено изцяло с култивирани клетки. Този факт определя рамката на всичко по-долу. Резултатите са реални и конкретни. Разстоянието между тях и каквото и да е лечение е също толкова ясно очертано.

Моделът: една мутация, един залепващ белтък

Прогерията започва със замяна на C с T на позиция 1824 в гена LMNA. Промяната не изменя аминокиселина. Тя активира скрито място за сплайсинг, което води до отпадане на 50 аминокиселини от белтъка ламин A. Скъсеният продукт, наречен прогерин, губи мястото за разцепване, което обикновено позволява на клетката да отстрани неговата фарнезилова котва. Така прогеринът остава трайно фарнезилиран и закрепен към вътрешната ядрена мембрана, докато нормалният ламин A периодично се свързва с нея и се отделя.

Последствията за ядрото са добре документирани и видими под микроскоп. Ядрата образуват издутини и се набръчкват, вместо да запазват гладка овална форма. Хетерохроматинът — плътно опакованата, транскрипционно неактивна ДНК, която обикновено покрива вътрешната периферия на ядрото — изтънява. Експресията на хиляди гени се променя. Представете си ядрената ламина като носеща конструкция зад тапет: когато един неин елемент е заварен на неправилното място, стената се издува и шарката на тапета се изкривява из цялата стая.

В проучването са използвани кожни фибробласти от пациенти с прогерия заедно с контролни клетки със същия брой пасажи, както и втора линия, модифицирана така, че нормални фибробласти да произвеждат прогерин директно. Модифицираните клетки развиват същите дефекти, което насочва към прогерина като причина, а не към историята на пациентите или времето, прекарано в култура. Тежестта на дефектите зависи от количеството: линията с по-висока експресия на прогерин показва по-тежки дефекти по всички показатели.

Как изглеждат митохондриите

Митохондриите в здравите фибробласти образуват разклонена околоядрена мрежа от дълги тубули, които се движат по пътищата на цитоскелета. В клетъчните линии с прогерия тази мрежа липсва. По-голям дял от митохондриите са фрагментирани, много са подути, а електронната микроскопия показва приблизително двукратно увеличение на силно увредените органели. Заснемането през определени интервали показва, че те изминават по-къси разстояния и се движат по-бавно от тези в контролните клетки.

Промените във функцията следват тези във формата. Нивата на митохондриалния супероксид и на окислителите в цялата клетка се повишават. Повече клетки показват нарушен мембранен потенциал. Производството на ATP спада. Взето поотделно, нищо от това не е изненадващо, тъй като увредените митохондрии отделят реактивни кислородни видове и произвеждат по-малко енергия. Новото е предложената причина. PGC-1alpha — транскрипционният коактиватор, който стимулира митохондриалната биогенеза чрез фактори надолу по регулаторната верига като NRF1, TFAM и регулаторите на сливането и деленето MFN1, MFN2, OPA1, FIS1 и DRP1 — е потиснат приблизително осемкратно на ниво mRNA в клетките с прогерия, със съответно намаляване и на белтъка. Изглежда, че прогеринът потиска главния регулатор на образуването и поддържането на митохондриите. Тази връзка между увреждането на ядрената ламина и енергийния метаболизъм е част от по-широкото описание на митохондриалното производство на енергия, а окислителната страна на същия баланс е разгледана в темата за оксидативния стрес и контрола на ROS.

Какво променя метиленовото синьо

Изследователите третират клетките с метиленово синьо в ниска концентрация от 100 наномолара непрекъснато в продължение на седмици. За клетъчна култура това е продължителна експозиция с ниска интензивност, а не кратък импулс на лекарствено вещество. Метиленовото синьо преминава циклично между окислена и редуцирана форма и може да пренася електрони в митохондриите. Затова то се описва като редокс съединение, насочено към митохондриите, а не като обикновен антиоксидант, който се изразходва при неутрализирането на един окислител.

Митохондриите реагират както в нормалните клетки, така и в клетките с прогерия. ATP се повишава, нивата на окислителите спадат, а делът на митохондриите с тежки дефекти намалява. Експресията на PGC-1alpha се възстановява частично, заедно с някои от регулираните от него мишени. Дотук това е общ ефект на подпомагане на митохондриалната функция, а не ефект, специфичен за прогерията.

Изненадата е в резултатите за ядрото, които са специфични за клетките със заболяването. Количественият анализ на формата показва намаляване на ядрените издутини. Общите количества на ламините A и C се повишават. Най-забележително е преразпределението на прогерина: в нетретираните клетки с прогерия само около 30 процента от него се намират в разтворимата нуклеоплазмена фракция, а останалата част е закрепена към мембраната. След третирането разтворимият дял се повишава до приблизително 65 процента, близо до нормалното поведение на ламините. Освободен от мембраната, прогеринът увлича със себе си по-малко съседни белтъци и разтворимите фракции на ламините A и C също се възстановяват.

Вследствие на това освобождаване се подобряват два ядрени фенотипа. Околоядреният хетерохроматин, изследван чрез електронна микроскопия и оцветяване за хетерохроматиновия белтък HP1-alpha, се възстановява видимо. А секвенирането на RNA показва, че транскриптомът се доближава отново до нормалния: нетретираните клетки с прогерия се различават от контролните по над 3,200 гена, докато третираните се различават по около 1,670. В нормалните клетки същото третиране променя само няколко десетки гена, което подкрепя идеята, че ядреният ефект е свързан с прогерина, а не представлява общо разместване на транскрипцията. Принципът, че клетъчните и животинските модели отговарят на по-тесни въпроси, отколкото подсказват заглавията за тях, е обяснен в как да четем изследванията за метиленовото синьо.

Защо това не е лечение

Четири ограничения задържат това проучване там, където му е мястото: в лабораторията.

Първо, всичко се случва в лабораторни съдове. Фибробластите в култура нямат кръвоснабдяване, имунен контекст, тъканна архитектура и фармакологичните условия на целия организъм, които определят дали дадено съединение изобщо достига до мишената си. В това проучване веществото не е прилагано на животни и не е лекуван нито един пациент.

Второ, фибробластите с прогерия са модел на един клетъчен тип. Заболяването води до смърт главно чрез засягане на артериите, костите и мастната тъкан, а проучването изследва само фибробласти и един препарат от гладкомускулни клетки. Други тъкани може да реагират различно.

Трето, възстановяването на ядрото е резултат от седмици непрекъсната експозиция на наномоларна концентрация в културална среда. Концентрациите в лабораторните съдове не са дози и нищо в статията не превръща 100 наномолара в средата в режим за приложение при хора. Метиленовото синьо има собствена зависимост доза–отговор и профил на безопасност в други области на медицината, а това проучване не дава основание за домашна употреба. Общият контекст за безопасността е разгледан в безопасност и странични ефекти на метиленовото синьо.

Четвърто, прогерията не е нормално стареене. Тя е рядко заболяване, причинено от една мутация, при което ядрената опорна структура се нарушава по специфичен начин. Съединение, което намалява това конкретно увреждане в култивирани клетки, казва малко за стареенето при хора без мутацията. Клетъчният фенотип е прозорец към взаимодействието между ядрото и митохондриите, а не резултат за дълголетие.

Следователно коректното обобщение важи при конкретни условия. Във фибробласти с прогерия прогеринът потиска PGC-1alpha и оставя митохондриите фрагментирани, бавноподвижни, с високи нива на окислители и ниско производство на енергия. Метиленовото синьо в ниска концентрация възстановява показателите за митохондриална функция във всички клетки и допълнително освобождава прогерина от ядрената мембрана в клетките със заболяването, с частично възстановяване на ядрената форма, хетерохроматина и генната експресия. Това двойно действие прави проучването заслужаващо внимание. То не превръща метиленовото синьо в терапия за прогерия или стареене.