Метиленово синьо в изследванията със зеброво данио: добавка при отглеждане и объркващ фактор в експериментите

Водата за хайвер на зеброво данио често е леко синя и почти никой не записва защо. Багрилото е метиленово синьо, добавяно срещу гъбички, а повечето протоколи го третират като фон. Тук „фон“ е погрешното понятие. По-подходящо е „неописан експериментален фактор“: вещество, което присъства в съдовете с третираните организми и отсъства в контролите, фармакологично активно е при използваните концентрации и може да промени именно показателите, които експериментът измерва.

Това разграничение е в основата на всичко по-долу. Рутинната противогъбична употреба при отглеждане е един въпрос. Дали добавката е неутрална спрямо вашия анализ е друг. Скорошната литература за зебровото данио дава успокояващ отговор на първия и обезпокоителен на втория.

Какво всъщност предписват насоките

Няма единен стандарт и това е част от проблема. Насоките на Канадския съвет за грижа за животните допускат 0.5 mg/L, или 0.00005%, в разтвора за транспортиране на хайвер и ларви, за да се ограничи растежът на гъбички. Европейските насоки за лабораторни животни описват ембриони, поддържани в среда, която често съдържа същите 0.00005%. Рецептата за E3 на Cold Spring Harbor посочва двойно повече — 1 mg/L, или 0.0001% — като съставка. На този фон се откроява съществен пропуск: насоката на OECD за изпитване на токсичността върху рибни ембриони предписва възстановена вода за разреждане и изпитваното химично вещество, без препоръка за метиленово синьо нито във версията от 2013, нито в по-късната редакция. Така една лаборатория отглежда ембриони на зеброво данио с метиленово синьо в синя вода още от първите часове на живота, друга провежда регулаторното изпитване с ембриони в безцветна вода, а и двете наричат средата си нормална. Всеки, който сравнява резултати между лаборатории или обединява исторически контроли, наследява това несъответствие.

За ориентир относно концентрациите: 0.00005% е приблизително 1.56 микромолара, а 0.0001% — приблизително 3.13 микромолара. Това са ниски стойности и е изкушаващо да ги приемем за твърде ниски, за да имат значение. Изследванията по-долу проверяват точно това предположение при точно тези концентрации.

Читателите, които идват от акваристиката, а не от лабораторията, срещат същата молекула в различен контекст, разгледан в ръководството за метиленово синьо в аквариума. Химията е същата; обяснението как багрилото пренася електрони в клетките показва защо редоксактивно съединение постоянно се появява в публикации за метаболизма. Следващите раздели се отнасят конкретно до водата за хайвер на зеброво данио с метиленово синьо.

Метаболизъм: ефектът променя посоката си според стадия

Най-информативното изследване излага нормално развиващи се риби зеброво данио на багрилото от първия ден на живота до 5 дни след оплождането и измерва окислителния метаболизъм на всеки стадий, както описва публикацията за експериментите с ембрионалния метаболизъм. Моделът заслужава внимателно описание, защото посоката се обръща.

На 1 ден след оплождането базалната консумация на кислород се повишава при изложените ембриони и при двете концентрации за отглеждане. На 2 дни потенциалът на митохондриалната мембрана в повърхностния слой на ларвите е повишен при експозиция на 0.00005%, 0.0001% и 0.0003%. Към 4 до 5 дни, след излюпването, посоката вече е обърната: окислителният енергоразход намалява, независимо дали експозицията е била непрекъсната от оплождането, или остра — само от ден 3 до ден 4. Успоредно с това количеството на транскриптите за субединици на митохондриалните дихателни комплекси намалява както на 1, така и на 4 дни, заедно с транскриптите, свързани със стероидогенезата и глюконеогенезата.

Още две наблюдения допълват картината. При по-високата концентрация за отглеждане излюпването настъпва малко по-рано: изложените ембриони изпреварват контролите на 2 дни, а до ден 3 контролите ги догонват. Самата ос на стресовия отговор изглежда запазена: когато 5-дневни ларви са подложени на стресор чрез завихряне, кортизолът в целия организъм се повишава нормално и в двете групи. Следователно при тези дози багрилото не е обща отрова за развитието и не потиска всяка физиологична реакция. То променя енергийния метаболизъм според стадия — нагоре преди излюпването и надолу след него.

Поведение: защо две изследвания се разминават и защо и двете могат да са прави

Литературата за поведението изглежда противоречива, докато схемите на експозиция не се сравнят една до друга. Едно изследване на безопасността по отношение на развитието и поведението излага ембриони от около 6 часа след оплождането на концентрации до 10 микромолара, подменя разтворите ежедневно до ден 4, след което премества ларвите в среда без багрило за дни 5 и 6 и изследва двигателната активност в тест със светли и тъмни периоди на ден 6. Резултатът: няма значим ефект върху смъртността, излюпването или морфологията и няма ефект от третирането върху двигателната активност. Авторите основателно препоръчват 10 микромолара като горна граница при своите условия.

Втора група, чиито автори отчасти съвпадат с тези на изследването за метаболизма, провежда експозицията така, както на практика протича отглеждането: багрилото присъства от 2 до 3 часа след оплождането, с ежедневна частична подмяна, а поведението се измерва по време на текуща или скорошна експозиция. При същите рутинни концентрации ларвите показват намалена двигателна активност в 24-часов тест, възпроизводима при различни линии и в различни лаборатории, а изследването на объркващите ефекти върху поведението свързва ефекта със серотонинергичния тонус, в съответствие с известното инхибиране на моноаминооксидазата от багрилото. Най-показателното е, че ембрионалната среда с метиленово синьо маскира очаквания двигателен отговор към флуоксетин, селективен инхибитор на обратното захващане на серотонина (SSRI). Следователно скринингов тест, проведен в синя вода, може да пропусне лекарствен ефект, който безцветната вода би разкрила.

Няма действително противоречие. В един тест съединението може да не оставя откриваем остатъчен ефект два дни след отстраняването си, а в друг да остава активно, докато присъства. Практическият прочит е, че нулевият резултат обосновава горна граница на концентрацията, а не твърдение за неутралност, докато положителният резултат описва съществения риск: активна експозиция в периода на измерване, при точно тази конфигурация, която повечето лаборатории използват.

Редокс багрило в редокс анализ

Още един капан заслужава отделен абзац, защото изкривява измерването, а не въздейства върху животното. Самият анализ на енергоразхода с Alamar Blue се основава на редокс химия: резазуринът се редуцира до флуоресцентен резоруфин. Метиленовото синьо също участва в редокс химия. В безклетъчните контроли и двете концентрации за отглеждане леко, но значимо понижават флуоресценцията на Alamar Blue след 24 часа. В експериментите с животни изложените ембриони са промити поне три пъти в среда без багрило преди анализа, а биологичният ефект при излюпените ларви надхвърля безклетъчното смущение. Следователно и двете са верни: при промитите животни се запазва реален метаболитен ефект, а неотстраненото багрило добавя пряк химичен артефакт към него. Контролите трябва да разграничат двете, иначе нито една стойност не означава нищо. Общите насоки за тълкуване на резултати от анализи с багрила тук са особено важни.

Хронология по стадии на развитие

Оригиналният материал за тази статия. Концентрациите са двете стандартни стойности за отглеждане — 0.00005% и 0.0001%, освен ако не е посочено друго.

Моделът, който трябва да се запомни, е ранно повишаване и по-късно понижаване на метаболитните показатели, с поведенчески ефекти, налични по време на експозицията и неоткриваеми след изчистване на веществото в единствения тест, който проверява това.

Контролен списък за планиране на контролите

Вторият оригинален материал. Използвайте го, когато протоколите с метиленово синьо за зеброво данио се пресичат с експеримент.

1. Описвайте багрилото като реагент, а не като вода. Посочвайте концентрацията както в проценти, така и в микромолари, началото и края в часове или дни след оплождането, графика на подмяна и периода без багрилото преди всяко измерване.
2. Съобразявайте контролите с въпроса. Изследването на изпитваното химично вещество изисква контроли без багрило; изследването на условията на отглеждане изисква групи без и с багрило, с отчитане на противогъбичния резултат, тъй като нито едно от цитираните изследвания не измерва противогъбичната ефикасност.
3. Промивайте преди редокс анализи, след това проверявайте. Промивайте поне три пъти в среда без багрило и успоредно провеждайте безклетъчна контрола с багрило и реагент, защото багрилото пряко понижава сигнала на Alamar Blue.
4. Приемайте поведенческите показатели и показателите, свързани с моноамините, за високорискови. Изследванията на двигателната активност, реакцията на стряскане, поведението, наподобяващо тревожност, антидепресантите и инхибиторите на MAO трябва да избягват багрилото по време на измерването или да доказват неутралност за конкретния показател; период без багрилото от един до два дни премахва един двигателен ефект, но това не е доказано за други експериментални модели.
5. Приемайте метаболитните и митохондриалните показатели за високорискови на всеки стадий. Консумацията на кислород, енергоразходът, мембранният потенциал и транскриптите за дихателната верига се променят при концентрациите за отглеждане, в противоположни посоки преди и след излюпването.
6. Не пренасяйте изводи за неутралност между различни експериментални схеми. Нулев резултат след отстраняване на багрилото не се отнася за текуща експозиция; нулев морфологичен резултат не се отнася за метаболизма или лекарственото взаимодействие; резултат при една линия, температура или продължителност на анализа не се отнася за други.
7. Посочвайте насоката, която сте следвали, и нейната алтернатива. Назовавайте изрично концентрациите според CCAC, европейските насоки или Cold Spring Harbor и отбелязвайте къде ембрионалното изпитване на OECD не включва багрилото, за да може читателят да разбере при какви условия са били вашите животни.

Нищо от това не е аргумент срещу използването на багрилото за запазване на жизнеспособността на хайвера. То е аргумент срещу това изборът при отглеждането да се пренася в данните без проверка. Синьото в съда е молекула с фармакологично действие, а експериментите, които най-вероятно ще бъдат изкривени, са именно високопроизводителните метаболитни и невроповеденчески скринингови изследвания, за които младите риби зеброво данио сега са предпочитани. Документирайте го, контролирайте го, отстранявайте го преди измерване и проверявайте анализа, в който може незабелязано да участва.