Метиленово синьо за оцветяване на ДНК и РНК: приложения в гелове и върху мембрани

Студент провежда електрофореза в агарозен гел, оцветява го с метиленово синьо и не вижда нищо там, където е очаквал ярка ивица. На съседното работно място постдокторант оцветява Northern мембрана със същото синьо багрило и получава отчетливи рибозомни ивици за три минути. Студентът заключава, че електрофорезата е неуспешна. Но тя не е неуспешна. Двете задачи са различни и едно и също багрило ги решава с различна чувствителност, различен фон и различни правила за последващите стъпки.

Оцветяването на ДНК и оцветяването на РНК с метиленово синьо имат обща химична основа, но различна цел. В гел багрилото показва колко нуклеинова киселина се намира в порестата матрица. Върху мембрана то показва дали прехвърлянето е било успешно и дали в пътечките са нанесени равни количества материал. Щом това разграничение стане ясно, протоколите, границите на откриване и ограниченията за съвместимост стават разбираеми.

Краткият отговор

Метиленовото синьо е планарно катионно багрило, което се свързва с нуклеиновите киселини нековалентно и обратимо чрез съчетание от електростатично привличане към фосфатните групи, интеркалация между базовите двойки и свързване в малката бразда. Именно обратимостта е важна. Ивиците могат да се оцветят и наблюдават на видима светлина, да се документират, а след това да се обезцветят или материалът да се пречисти за клониране, хибридизация или повторно изследване със сонда.

За оцветяване на двойноверижна ДНК с метиленово синьо в агарозен гел стандартната бърза рецепта е 0.02 процента w/v (200 микрограма на mL) във вода, около 15 минути оцветяване плюс около 15 минути обезцветяване с вода и наблюдение върху осветител с бяла светлина. За мембрани класическата рецепта за Northern блот е 0.02 до 0.04 процента багрило в натриев ацетат при pH около 5.2, няколко минути оцветяване след прехвърляне и имобилизиране, последвано от изплакване с вода и пълно обезцветяване преди хибридизация. Чувствителността е умерена: десетки до стотици нанограми на ивица в гела при добри условия, а консервативните ръководства посочват 0.5 до 1 микрограм. Това е с порядъци над границите при етидиев бромид и багрилата SYBR. За мембрани няма полезна единна граница на откриване на отделен транскрипт, защото оцветяването показва главно изобилната рибозомна РНК и общото количество нанесен материал. Не използвайте разтвор, продаван като хранителна добавка, вместо реагента в която и да е от двете рецепти. Валидираните методи предполагат багрило с аналитична чистота, буфери с определен състав и работа без RNase, когато се използва РНК.

Как действа свързването и кога може да подведе

Полезният модел има три части. Първо, положително заредената пръстенна система се привлича от отрицателно заредения фосфатен скелет. Спектроскопските изследвания установяват, че това електростатично взаимодействие преобладава при ниска концентрация на соли, докато моделирането и молекулярната динамика определят интеркалацията и свързването в малката бразда като стабилни режими за двойноверижната ДНК, както е обобщено в спектроскопско изследване на свързването на метиленово синьо с ДНК. Второ, има известно предпочитание към GC: моделирането показва предпочитание към стъпките CpG и GpC, а експериментите отчитат преимуществено свързване с богати на GC дуплекси в изследванията на предпочитанията при интеркалация на метиленовото синьо, но AT дуплексите също се свързват. Рутинното оцветяване не е специфично за определена последователност. Трето, едноверижните ДНК и РНК се свързват главно чрез електростатични взаимодействия и стекинг с достъпни бази и дуплексни участъци, поради което интензивността на оцветяването зависи от дължината, последователността и вторичната структура.

От това следват две последици. Тъй като свързването е нековалентно, багрилото се отмива. Ивиците в полиакриламид избледняват бързо, освен ако не бъдат специално фиксирани, а отделен вариант с трайна фиксация съществува именно защото обичайното оцветяване е временно, както е описано от Soto и Draper за PAGE гелове. Тъй като багрилото е фотосенсибилизатор, продължителното силно осветяване на оцветена ДНК в присъствието на кислород може да окисли гуанина и в крайна сметка да причини едноверижни прекъсвания — механизъм, подробно разгледан в изследване на окислението на гуанин, сенсибилизирано от метиленово синьо. Краткото наблюдение на бяла светлина избягва добре известното UV увреждане при класическите процедури с етидиев бромид и това предимство е реално при препаративно извличане. Видимата светлина е по-щадяща, но не е безвредна. Ограничете времето на осветяване, когато ДНК ще се клонира. За по-широкия фотохимичен контекст на тази предпазна мярка вижте двата пътя във фотохимията на метиленовото синьо. За редокс двойката и зарядните състояния, които обясняват защо окислената форма се свързва, а редуцираната — не, вижте химията на структурата и свойствата на метиленовото синьо.

Първа задача: оцветяване в гелове

Оцветяването на гел отговаря на един въпрос: има ли достатъчно нуклеинова киселина в тази ивица, за да се вижда с просто око. Двойноверижната ДНК в агароза е най-добре характеризираният случай. Оригиналният метод на Flores и колеги за оцветяване на гел с метиленово синьо валидира бързия протокол с 0.02 процента върху 1 процент агароза и показва успешно последващо извличане и клониране. Същият протокол на доставчика е публикуван на продуктовата страница за метиленово синьо на IBI Scientific, където рецептата с 0.04 процента за мембрани и бързият вариант за гелове са представени един до друг.

Практическа процедура:

1. Проведете електрофорезата по обичайния начин. Оцветявайте след електрофорезата, а не по време на нея, освен ако прехвърлянето или разделителната способност не са валидирани за модифициран метод.
2. Потопете в 0.02 процента w/v метиленово синьо в дестилирана вода, с леко разклащане, за около 15 минути.
3. Обезцветявайте с няколко смени на водата, общо около 15 минути, докато фонът на матрицата намалее и ивиците се откроят.
4. Снимайте незабавно върху осветител с бяла светлина.

Агарозата и полиакриламидът се държат различно. Агарозата задържа багрилото в матрицата, затова обезцветяването е бавната стъпка. Тънките полиакриламидни гелове се оцветяват бързо, но и бързо губят багрилото, което улеснява препаративното изрязване, но затруднява архивната документация. Синтетичните олигонуклеотиди в полиакриламид могат да се локализират със същата рецепта с 0.02 процента за 20 до 30 минути с многократни промивания с вода, следвайки установени PAGE методи от типа на Current Protocols. Описани са силно разредени варианти около 0.0002 процента в разреден TBE за препаративни олигонуклеотиди с продължителност няколко часа, но доказателствената база е по-слаба.

Разликата между ДНК и РНК има значение. Двойноверижната ДНК осигурява най-силното структурно обусловено свързване. РНК и едноверижната ДНК се оцветяват, но по-слабо и по-непредвидимо. При агарозни гелове с формалдехид за РНК повечето лаборатории пропускат оцветяването със синьо багрило в гела и първо прехвърлят РНК върху мембрана, а след това оцветяват там. Така слабият сигнал в гела се заменя с по-отчетлив сигнал върху мембраната и с документ за нанесеното количество.

Втора задача: оцветяване върху мембрани

Оцветяването на мембрана отговаря на друг въпрос: успешно ли е прехвърлянето и съпоставими ли са пътечките. Класическото приложение е обратимото оцветяване на Northern блот по Herrin и Schmidt, първоначално с 0.04 процента багрило в 50 mM натриев ацетат при pH 5.0 за 2 до 3 минути, с изплакване с вода и отстраняване с разреден SDS в SSPE преди хибридизация.

Широко използваният съвременен вариант протича така:

1. Прехвърлете РНК или денатурирана ДНК върху найлон или нитроцелулоза, след което имобилизирайте чрез UV омрежване или нагряване, за да не се загуби пробата при оцветяването.
2. Незадължителна, но често използвана стъпка: намокрете мембраната в 5 процента оцетна киселина за около 15 минути.
3. Оцветявайте 5 до 10 минути в 0.02 до 0.04 процента метиленово синьо в 0.3 до 0.5 M натриев ацетат при pH около 5.2.
4. Изплакнете и обезцветявайте във вода за 5 до 15 минути, документирайте, след което отстранете остатъчното багрило преди хибридизация.

Положително зареденият найлон преобладава при работата с Northern блот. Нитроцелулозата също е подходяща за същата процедура с оцетна киселина и ацетат. Изображението се използва за потвърждаване на прехвърлянето, сравняване на ивиците 28S и 18S (или 23S и 16S при бактериална РНК), отбелязване на маркери и стандарти и водене на приблизителен запис за нормализиране спрямо общата РНК. Публикувани Northern методи количествено оценяват оцветените рибозомни ивици за проверка на нанесеното количество, включително изследване в областта на науката за млякото, което използва рибозомни ивици, оцветени с метиленово синьо, за нормализиране. Southern мембраните могат да се визуализират по същия начин, но багрилото е много по-утвърдено като средство за проверка на нанесеното количество и прехвърлянето при Northern блот. Освен това ДНК за Southern блот се денатурира преди прехвърлянето, така че стойностите за чувствителност в гелове не се пренасят пряко.

Граници на откриване и фон: къде синьото багрило отстъпва

Сравнението по-долу умишлено е приблизително. Ефективността на оцветяването зависи от процентното съдържание на гела, ширината на ивиците, оптиката и стриктното обезцветяване. Приемайте всяка стойност като порядък на величината, а не като спецификация.

Контролът на фона определя дали умереният сигнал е използваем. Свободното багрило е силно оцветено, затова контрастът се получава чрез отстраняване на несвързаното багрило, без да се отмива свързаното. По-концентрираният разтвор рядко повишава чувствителността. Той главно удължава обезцветяването. Изследвайте серия от разреждания с конкретните гел, мембрана и камера и използвайте само диапазона, в който интегралната плътност остава пропорционална на внесеното количество. Метиленовото синьо позволява полуколичествено нормализиране на нанесеното количество. То не е количествен метод с широк динамичен диапазон, защото капацитетът на мембраната, ефективността на прехвърляне, насищането и обезцветяването се различават между пътечките.

Ограничения за съвместимост: какво остава възможно след оцветяването

Клонирането след оцветяване със синьо багрило е демонстрирано. Flores и колеги изрязват оцветени агарозни ивици, извличат ДНК, лигират я и я използват за трансформация, като съобщават по-добри резултати при клониране в сравнение с етидиев бромид и UV. Вероятната причина е по-малкото фотоувреждане, а не благоприятен ефект на самото багрило. Поддържайте кратко излагане на бяла светлина и пречиствайте извлечената ДНК чрез стандартна процедура за екстракция от гел.

Доказателствата за PCR и секвениране са по-ограничени. Остатъчното багрило се свързва с нуклеиновите киселини, затова обезцветявайте и пречиствайте преди ензимни стъпки. Очаква се правилно пречистената ДНК от синьо оцветен гел да е подходяща, но поносимостта към директно пренасяне на остатъчно багрило при различни полимерази и химични системи за секвениране не е добре количествено определена. Не я приемайте за даденост.

Блот хибридизацията е съвместима, когато редът се спазва стриктно: прехвърляне, имобилизиране, оцветяване, документиране, обезцветяване, хибридизация. Това е последователността на Herrin и Schmidt. Оцветяването преди прехвърляне или пропускането на обезцветяването представлява различен метод и изисква собствено валидиране. След отстраняване на багрилото стандартното отстраняване на сондата и повторното изследване със сонда протичат нормално. За оцветяване на клетъчно ниво със същата група багрила и за причините подходът при фиксирани натривки да не се прилага пряко към методите за живи клетки вижте атласа за микроскопско оцветяване.

Изрязването на ивици е приложимо за препаративна агароза и за PAGE олигонуклеотиди, локализирани със синьо багрило, при условие че се избягва вариантът с трайна фиксация. Електроелуцията след обезцветяване е химически правдоподобна при обратимо свързващо се багрило, но контролираните данни за добива конкретно при метиленово синьо са оскъдни. След елуиране отстранете солите или утаете материала.

Повтарящи се проблеми

Бледите ивици в гела обикновено означават твърде малко количество за колориметрично оцветяване, особено при къси едноверижни мишени или РНК. Нанесете повече материал, използвайте пресен оцветяващ разтвор, удължете оцветяването, преди да повишите концентрацията, и прекратете обезцветяването по-рано. Равномерно син гел без контраст обикновено означава прекомерно оцветяване или твърде малко смени на водата. Избледняването на PAGE ивиците е очаквано химично поведение, а не неуспешно оцветяване. Снимайте бързо. Неравномерният фон на мембраната насочва към гънки, мехурчета, отпечатъци от пръсти, неравномерно разклащане или неравномерно прехвърляне. Не го тълкувайте като неравно нанесено количество без контрол чрез хибридизация. Размазан и слаб рибозомен профил може да означава разграждане, но също и непълно прехвърляне, твърде малко обща РНК (обичайно в пътечките се нанасят от няколко до десетки микрограми) или прекомерно обезцветяване. Багрилото показва изобилната рибозомна РНК. То не показва конкретен транскрипт. Това е задачата на сондата.

Безопасност и работа без преувеличени твърдения

С метиленовото синьо се работи по-лесно, отколкото с етидиевия бромид, но то не е безвредно. Актуален информационен лист за безопасност на MilliporeSigma класифицира багрилото като вещество с остра токсичност при поглъщане, категория 4 — вредно при поглъщане, с изискване за обезвреждане по одобрен ред съгласно информационния лист за безопасност на метиленово синьо от Sigma-Aldrich. Етидиевият бромид има по-сериозни предупреждения за генотоксичност, включително подозирани ефекти върху зародишните клетки в неговия информационен лист за безопасност от Sigma-Aldrich, а геловете и разтворите му обикновено се събират отделно като опасни химични отпадъци, както е посочено в ръководството на Thermo Fisher за багрила за нуклеинови киселини. Спазвайте информационните листове за безопасност и правилата на институцията и за двете вещества. Съхранявайте сухото багрило плътно затворено и на сухо, използвайте повторно работния оцветяващ разтвор само доколкото протоколът позволява, съхранявайте оцветените мембрани сухи между листове филтърна хартия и снимайте геловете, преди ивиците да се разсеят чрез дифузия.

Запомнете практическото правило. Геловете проверяват видимостта при голямо нанесено количество под бяла светлина. Мембраните проверяват прехвърлянето и нанесеното количество, преди сондата да извърши чувствителното откриване. Едно багрило служи и за двете задачи — с умерена чувствителност, обратимо свързване и строг ред на операциите.