Метиленово синьо и възпалителна сигнализация: инфламазоми, IL-6 и STAT3

Да предположим, че три лаборатории съобщават, че едно и също синьо съединение има противовъзпалително действие. Едната установява по-малко IL-1beta от макрофагите. Другата установява по-малко от ензима iNOS в същия тип клетки. Третата установява по-малко IL-6 в кръвта и по-ниска активност на STAT3 в мозъка. Изкушаващо е трите резултата да се обединят в едно твърдение. Това обединяване прикрива същината на наблюденията.

Всеки резултат се отнася до различен сигнален механизъм със собствен активиращ стимул, етап на сглобяване и измерван показател. Метиленовото синьо въздейства върху всеки механизъм на различно място. Дали нещо от това подобрява здравните резултати е отделен въпрос, разгледан в нашия обзор за метиленовото синьо и възпалението. Тази страница се фокусира върху сигналните пътища.

Път 1: сглобяване на инфламазоми и каспаза-1

Инфламазомата е белтъчен комплекс, който се изгражда при необходимост в миелоидна клетка. Съставните му части са сензор, адаптор, наречен ASC, и ефекторен ензим, наречен каспаза-1. След сглобяването каспаза-1 разцепва pro-IL-1beta и pro-IL-18 до техните секретирани форми и може да задейства пироптоза — възпалителна форма на клетъчна смърт. Сензорът определя типа: NLRP3 реагира на кристали и порообразуващи токсини, като нигерицин и ATP, NLRC4 реагира на бактериален флагелин, AIM2 реагира на цитозолна двуверижна ДНК, а неканоничният път реагира на вътреклетъчен липополизахарид.

За активирането са необходими два сигнала. Първият сигнал е подготвителен: лиганд на Toll-подобен рецептор стимулира зависимата от NF-kB транскрипция на NLRP3 и pro-IL-1beta, така че необходимите компоненти да са налични. Вторият сигнал е сглобяването: втори стимул предизвиква олигомеризация на ASC в точковидни агрегати, разцепване на каспаза-1 до нейния фрагмент p20 и освобождаване на зрелия IL-1beta p17. Известно е, че митохондриалните реактивни кислородни видове и поглъщането на кристали допринасят за втория сигнал при NLRP3.

Проучването от 2017 г. върху широкообхватното инхибиране на инфламазоми в макрофаги изследва метиленовото синьо при двата сигнала. В миши макрофаги от костен мозък, предварително подготвени с липополизахарид, нигерицинът, ATP и кристалите на мононатриев урат поотделно предизвикват освобождаване на IL-1beta и каспаза-1, както и образуване на точковидни агрегати на ASC. Метиленовото синьо при концентрации от 20 до 200 micromolar намалява и трите показателя по дозозависим начин, без да убива клетките. Флагелинът и Salmonella за NLRC4, двуверижната ДНК и Listeria за AIM2, както и трансфектираният липополизахарид или живите E. coli за неканоничния път показват същия модел. Самото съединение не предизвиква освобождаване, а контролните плаки не показват антибактериален ефект, така че резултатът се отнася до отговора на гостоприемника.

На по-ранни етапи от пътя са измерени три въздействия. Предизвиканият от ротенон митохондриален супероксид намалява при метиленово синьо, а заедно с него намалява и стимулираното от ротенон освобождаване на IL-1beta. Поглъщането на флуоресцентни микросфери намалява, което е съвместимо с понижена фагоцитоза преди разпознаването на кристали. Репортер, управляван от промотора на NLRP3 с два участъка за NF-kB, показва по-ниска активност при метиленово синьо, докато скъсен промотор без тези участъци не реагира. В епруветка без клетки метиленовото синьо също пряко понижава активността на рекомбинантна човешка каспаза-1. Добавянето на съединението само при подготвителния етап или само при активирането все пак намалява освобождаването на IL-1beta, IL-18 и каспаза-1, така че са засегнати и двата етапа.

Изпитванията при мишки съответстват на тази селективност. Смъртоносна доза липополизахарид убива контролните животни в рамките на часове, докато метиленовото синьо подобрява преживяемостта; IL-1beta в перитонеалната течност намалява, но IL-6 в същата течност не намалява. В модел на перитонит, предизвикан от Listeria, перитонеалният IL-1beta намалява, докато общият брой клетки остава непроменен. Човешките моноцити THP-1 реагират подобно на мишите макрофаги при всичките четири типа инфламазоми. Резултатът за инфламазомите обяснява съзряването на IL-1beta и IL-18, а не на всеки цитокин. Затова и формата на имунните клетки в мозъка в експериментите с микроглия и астроцити отговаря на различен въпрос от сглобяването на белтъчния комплекс.

Път 2: транскрипция на iNOS чрез свързване на NF-kB и STAT1

Индуцируемата синтаза на азотен оксид, или iNOS, почти липсва в покой и се транскрибира при необходимост. Липополизахаридът я стимулира главно чрез разграждане на IkB-alpha, последвано от фосфорилиране на NF-kB и навлизането му в ядрото. Интерферон-гама я стимулира главно чрез фосфорилиране на STAT1 от Janus киназа, последвано от навлизането на STAT1 в ядрото. След това всеки фактор се свързва със своя участък върху промотора на iNOS. Ензимната активност и индуцирането на гена са отделни контролни точки и дадено лекарство може да действа върху едната или върху двете.

Проучването от 2015 г. за индуцирането на iNOS в макрофаги и мишки с ендотоксемия локализира ефекта на нивото на информационната РНК. В клетки RAW 264.7 и първични миши макрофаги метиленово синьо с концентрация 1 micromolar, приложено 30 минути преди липополизахарид, интерферон-гама или двата заедно, намалява белтъка и иРНК на iNOS за период от 8 до 24 часа, с по-ниски нива на нитрити в средата и без загуба на жизнеспособност. При мишки, получили 25 mg per kg липополизахарид, еднократна доза от 5 mg per kg един час по-рано намалява белтъка и иРНК на iNOS в белите дробове, черния дроб и сърцето.

Отличителната подробност е какво не се променя. Разграждането на IkB-alpha, фосфорилирането на NF-kB, фосфорилирането на STAT1 и натрупването на двата фактора в ядрото остават незасегнати. Нарушението настъпва един етап по-късно: ядрените екстракти показват по-слабо свързване на NF-kB със съответния му ДНК елемент след липополизахарид и по-слабо свързване на STAT1 след интерферон-гама. Хроматиновата имунопреципитация потвърждава по-ниска заетост на промотора на iNOS от двата фактора вътре в клетките. Тумор-некротизиращият фактор алфа, чийто промотор също използва NF-kB, също намалява. Факторите са активирани и достигат ядрото, но се свързват слабо с целевата си ДНК.

Обърнете внимание на разликата спрямо път 1. Тук става дума за свързване на фактор с ДНК, участва STAT1, а не STAT3, и се измерват иРНК, белтък и нитрити, а не точковидни агрегати на ASC и фрагменти на каспаза-1. Нашата карта на мишените на метиленовото синьо в клетъчни модели разглежда това транскрипционно ниво отделно от преките ензимни и митохондриални измервания.

Път 3: серумен IL-6 и активиране на STAT3 в тъканите

IL-6 предава сигнали чрез семейството рецептори gp130 към каскадата от Janus киназа до STAT3. Фосфорилираният STAT3 образува димери, навлиза в ядрото и задейства възпалителни програми, докато самият IL-6 е мишена на NF-kB. Така двата образуват контур на обратна връзка, често наричан ос IL-6–STAT3. Стандартните измервани показатели са серумният IL-6 в началото на пътя, съотношението между фосфорилирания и общия STAT3 и ефекторните ензими като iNOS и COX2 в по-късните етапи.

Проучването от 2023 г. при мишки за IL-6 и STAT3 след липополизахарид измерва тази ос в различни биологични компартменти. Мъжки мишки C57BL/6 получават 1 mg per kg липополизахарид дневно в продължение на три дни, с 5 или 10 mg per kg метиленово синьо 30 минути след всяка доза. На третия ден серумният IL-6 е по-нисък и в двете групи с метиленово синьо, отколкото при липополизахарид самостоятелно, докато повечето други цитокини в панела не се променят при третирането. Съотношенията между фосфорилирания и общия STAT3 са по-ниски в кората, хипокампа и кожата на ухото, с по-слабо оцветяване на микроглията за Iba-1, по-ниски iNOS и COX2 и частично ограничена загуба на тегло.

Тук са необходими две уточнения. По-ниският серумен IL-6 заедно с по-ниското фосфорилиране на STAT3 в тъканите е съвместим с модулиране на оста, но не изолира първичната точка на въздействие. По-малко цитокин в началото на пътя, по-слаба рецепторна сигнализация или променена фосфатазна активност могат поотделно да доведат до същото съотношение. Освен това теглото през три дни на остро експериментално въздействие е показател на ниво цял организъм, а не оценка на симптоми или ремисия. То добавя контекст отвъд резултата от блот анализ, без да превръща резултата за сигнализацията в твърдение за лечение. Отделните химични процеси на митохондриална редокс регулация протичат успоредно с описаните цитокинови механизми и не бива да се сливат с тях.

Сравнение на пътищата: точки на въздействие и измервани показатели

Таблицата предотвратява три неправомерни пренасяния на изводи. Резултат за точковидни агрегати на ASC не доказва резултат за STAT3. Резултат за свързването на STAT1 с промотора на iNOS не доказва резултат за STAT3, въпреки че и двата белтъка са членове на семейството STAT. Резултат за серумния IL-6 не доказва намалено сглобяване на инфламазоми: в перитонеалния експеримент IL-1beta намалява, докато IL-6 не намалява. Всеки ред изисква собствен активиращ стимул и измерван показател. Затова при четене на клетъчни, животински и клинични проучвания на метиленовото синьо всяко твърдение трябва да се съпоставя с нивото, на което е направено измерването.

Нищо от това не установява дозиране, безопасност или полза при хора. Моделите с липополизахарид са контролирани стимули за изследване на механизъм, а не копия на хронично заболяване. Прилагането на съединението едновременно с активиращия стимул проверява предотвратяването на предизвикана промяна, а не обръщането на вече установено заболяване. Разглеждайте това описание на механизмите отделно от резултатите при пациенти и оценявайте всяко здравно твърдение според проучването при пациенти, което го подкрепя.