Метиленово синьо в лабораторните тестове за G6PD: какво всъщност прави багрилото

Студент наблюдава две епруветки след инкубация. Едната е придобила очаквания цвят. Другата — не. Студентът заключава, че вторият пациент има дефицит на глюкозо-6-фосфат дехидрогеназа. Това заключение може да е правилно, но разсъждението пропуска принципа, на който се основава тестът. Нищо в епруветката не измерва ензима пряко. В епруветката се измерва това, което ензимът произвежда, а метиленовото синьо служи като посредник.

Щом този косвен механизъм стане ясен, процедурата, контролите и дългият списък с погрешни резултати вече не изглеждат произволни.

Краткият отговор

Метиленовото синьо в тестовете за G6PD е окислително-редукционен индикатор. Ензимът G6PD образува NADPH, а NADPH-зависимите системи редуцират синьото метиленово синьо до безцветната му левкоформа (или го използват за пренос на електрони). Нормалната ензимна активност осигурява ефективна редукция. Дефицитната активност води до бавна или непълна редукция. Именно това е целият сигнал.

Два исторически метода използват едно и също багрило, но се различават по крайния показател. Ако ги разграничите, повечето обърквания изчезват.

Два теста, едно багрило, различни крайни показатели

Първият е директният тест за редукция на метиленово синьо, описан от Sass и сътрудници и по-късно оценен от Gibbs. При него крайният показател е самото багрило: окисленото синьо метиленово синьо се редуцира до безцветно левкометиленово синьо, а скоростта на тази промяна отразява капацитета за образуване на NADPH. Първоначалната публикация за скрининговия метод е индексирана в PubMed под Sass и сътр. (1966).

Вторият е тестът на Brewer за редукция на метхемоглобин. Най-напред натриевият нитрит окислява хемоглобина до кафяв метхемоглобин. След това метиленовото синьо действа като посредник при преноса на електрони: редуцираното метиленово синьо предава редуциращи еквиваленти на метхемоглобина, превръщайки го обратно в червен хемоглобин. Следователно видимият краен показател е кафяво спрямо червено, а не синьо спрямо безцветно. Оригиналният метод е публикуван в Бюлетина на Световната здравна организация (Brewer и сътр., 1960).

Да се нарича анализът на Brewer тест за обезцветяване на багрило е химически неточно. Багрилото преминава през окислително-редукционен цикъл; хемоглобинът променя цвета си. Диаграмата по-долу проследява и двата пътя.

Основната реакция

G6PD катализира първата окислителна стъпка на пентозофосфатния път:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Зрелите еритроцити разчитат в голяма степен на този път за получаване на NADPH, както е разгледано в обзора на Luzzatto и сътрудници в Blood (2020). NADPH поддържа глутатиона в редуцирана форма и предпазва клетката от окислително увреждане. Метиленовото синьо се включва в тази система като акцептор на електрони. Достатъчната активност на G6PD осигурява достатъчно NADPH, което позволява ефективна редукция. Ниската активност на G6PD прекъсва веригата още в първото ѝ звено.

Мислете за багрилото като за указател за горивото, а не като за двигателя. То показва наличността на NADPH. Всичко друго, което променя тази наличност или отчитането на резултата, може да премести стрелката, без да има каквато и да било промяна в гена.

Как протича процедурата от типа на Brewer

Съставът на реактивите се е променял през десетилетията, затова описанието с учебна цел не бива да се приема за клиничен протокол. Всяка лаборатория следва собствената си валидирана стандартна оперативна процедура. С тази уговорка класическият метод с епруветки протича по следния начин, във вариант с три епруветки и 3-часова инкубация, документиран в това публикувано приложение на метода:

1. Епруветка с пробата на пациента: цяла кръв плюс глюкоза, натриев нитрит и метиленово синьо. Нитритът образува метхемоглобин, глюкозата подхранва метаболизма на еритроцитите, а багрилото осигурява NADPH-зависимия пренос на електрони.
2. Окислена контрола: кръв плюс нитрит и глюкоза, но без метиленово синьо. Тя показва кафявия краен цвят на метхемоглобина — образеца за дефицит.
3. Хемоглобинова контрола: кръв плюс вода. Тя показва червения краен цвят на хемоглобина — нормалния образец.
4. Инкубирайте всички епруветки при температура около 37 C, обикновено за 3 часа, като разбърквате внимателно.
5. Разредете малка аликвотна част от всяка епруветка с дестилирана вода, за да лизирате клетките и да направите цветовото сравнение ясно.
6. Сравнете епруветката с пробата на пациента с двете контроли. Връщането към червен цвят показва значителен редукционен капацитет. Запазването на кафявия цвят насочва към изразен дефицит.

Една историческа рецептура използва около 1 mL кръв с реактиви с концентрации приблизително 180 mM натриев нитрит, 280 mM декстроза и 0.4 mM метиленово синьо. Приемайте тези стойности като пример от литературата, а не като универсална спецификация.

Разчитане на резултата

Качественият скрининг разграничава най-добре резултатите около 30 до 40 процента от нормалната активност, както е обсъдено в този обзор в Malaria Journal за пропуските при откриването на дефицит на G6PD. Следователно нормалният скринингов резултат означава, че анализът не е открил тежък дефицит. Той не удостоверява напълно нормална активност.

Защо скринингът може да подведе

Ретикулоцитозата след хемолиза е класическата причина за фалшиво нормален резултат. Младите еритроцити и ретикулоцитите съдържат повече G6PD от старите клетки. По време на остър хемолитичен епизод най-старите клетки с най-изразен дефицит може вече да са разрушени, оставяйки млада клетъчна популация, чиято активност при изследване изглежда нормална. Същият биологичен механизъм подвежда и количествените анализи, не само скрининговите тестове с багрило.

Скорошното кръвопреливане прикрива дефицита, защото донорските еритроцити внасят собствения си ензим в пробата. Mayo Clinic Laboratories посочва кръвопреливането сред причините за ненадеждни резултати от ензимни изследвания, наред с ретикулоцитозата и влиянието на левкоцитите.

Хетерозиготните жени са най-трудният случай. Случайното инактивиране на X-хромозомата създава смес от нормални еритроцити и еритроцити с дефицит, а общата активност може да бъде навсякъде в диапазона от тежък дефицит до привидно нормална стойност. Качествените скринингови тестове често пропускат междинните фенотипове. Документацията на СЗО за изследването на G6PD разглежда подробно това ограничение.

Времето от вземането на пробата, температурата на съхранение, субективността на визуалната оценка на крайния цвят, хематокритът и качеството на реактивите добавят аналитична вариабилност към тези биологични ефекти.

Скринингът не е диагноза

Скринингов резултат, който показва дефицит, е междинен или не съответства на клиничната картина, изисква количествено изследване на ензимната активност на G6PD. СЗО приема количествената спектрофотометрия с контролирана температура за референтен подход. При този анализ към еритроцитен хемолизат се добавят глюкозо-6-фосфат и NADP+, а образуваният NADPH се проследява чрез нарастването на абсорбцията при 340 nm. Скоростта на промяната е пропорционална на ензимната активност, обикновено изразена спрямо хемоглобина като единици на грам. Съвременната клиничнолабораторна практика е обобщена в описанието на изследването за активност на G6PD в каталога на Mayo.

При интерпретацията се използва валидираният от лабораторията референтен интервал, често определен спрямо нормалната активност в популацията, като дефицитът обикновено се обсъжда около прага от 30 процента, а междинната активност — над него. Целевите продуктови профили на СЗО за тестове за G6PD (2022) описват тази диагностична рамка. Ако скорошна хемолиза или кръвопреливане прави фенотипното определяне ненадеждно, повторете изследването след възстановяване на равновесието в еритроцитната популация; молекулярното изследване може да добави информация, без да заменя измерването на ензимната активност.

Разграничение, което си струва да се запази

Метиленовото синьо в тези анализи е лабораторен реактив за употреба ex vivo. Този факт принадлежи към различна тема от безопасността при прилагане на метиленово синьо на пациент, която е разгледана в насоките за противопоказанията на метиленовото синьо. Биохимията свързва двете теми, тъй като лекарството също зависи от NADPH-зависима редукция, но багрило в епруветка не е доза в кръвообращението. За контекст относно поведението на багрилото като оцветител в друга среда вижте принципите на оцветяване с метиленово синьо, а за химичната група, към която принадлежи — окислително-редукционните багрила в лабораторията.

Скринингът проверява дали редукционният капацитет изглежда запазен. Потвърдителното изследване установява колко ензим действително е наличен. Багрилото служи добре за първия въпрос, стига никой да не очаква от него да отговори на втория.