Метиленово синьо и АЛС: защо резултатите се различават между експерименталните модели

Ако потърсите метиленово синьо и АЛС, ще откриете две твърдения, които изглеждат противоречиви. Според едното синьото багрило защитава невроните в модели на АЛС. Според другото то няма ефект при мишка с АЛС. И двете твърдения се позовават на реални публикации и двете публикации заслужават сериозно внимание. Противоречието изчезва, когато формулирате идеята зад всеки експеримент: моделът определя твърдението.

Резултатът при червей е твърдение за червей. Резултатът при риба в ларвен стадий е твърдение за риба в ларвен стадий. Нито един от тях не е твърдение за пациент, докато това не се потвърди при проследяване на хода на заболяването при бозайник. Тази статия сравнява двете най-често цитирани публикации, за да видите защо отговорите им се различават.

Двата експеримента в една таблица

Дръжте тази таблица отворена, докато четете. Тя обхваща всяка важна разлика между проучванията.

Генетичните особености се различават, видовете се различават, пътят на приложение се различава, моментът на започване се различава и крайните показатели се различават. Генотипът е само една от петте разлики, затова двете проучвания не могат да докажат, че метиленовото синьо действа избирателно върху един механизъм на АЛС. Те доказват нещо по-ограничено, но все пак полезно: изразеното възстановяване при ранна директна експозиция в прости модели не се пренася към хода на заболяването при бозайник с продължително приложение през устата.

Положителният резултат: какво показва проучването при червеи и риби

В проучването при червеи и риби от 2012 г. мутантен човешки TDP-43 или FUS се експресира в двигателните неврони на червеите, а в рибните ембриони се инжектира мутантна човешка иРНК. Това са модели на протеотоксичност. Те възпроизвеждат токсичните ефекти на мутантния белтък върху движението и формата на невроните в рамките на дни, а не пълния ход на АЛС при възрастни хора в продължение на години.

Третирането започва много рано. Червеите се развиват върху агар, съдържащ метиленово синьо, още от излюпването. Рибните ембриони престояват в разтвор на веществото през нощта, започвайки 24 часа след оплождането, а поведението им се изследва около два дни по-късно. Между веществото и неврона няма кръвно-мозъчна бариера по начина, по който тя съществува при бозайник, и не са измерени концентрации на веществото в плазмата или мозъка.

При тези условия ефектите са големи и последователни. И 6, и 60 μM намаляват възрастово зависимата парализа при червеите с TDP-43 и FUS. На 12-ия ден от зрелия стадий приблизително 80 процента от нетретираните червеи с TDP-43 са парализирани, спрямо около 10 процента от червеите, третирани от излюпването. Синаптичният тест показва същата посока: червеите с TDP-43 са свръхчувствителни към алдикарб — вещество, с което се изследва нервно-мускулното предаване — а метиленовото синьо измества отговора обратно към нормалното. Броят на дегенериращите израстъци на двигателните неврони намалява, като най-ясният ефект е при 60 μM. При рибите плуването, предизвикано от докосване, се подобрява значително, а скъсените двигателни аксони отново нарастват към нормалната си дължина при 30 или 60 μM, макар възстановяването да е частично, а не пълно.

Данните за оксидативния стрес са съвместими с антиоксидантно обяснение. Мутантните червеи и риби показват повишени показатели за реактивни кислородни видове, които намаляват при третиране, а нормалните червеи, изложени на метиленово синьо, оцеляват много по-дълго при прооксидантно въздействие от нетретираните червеи. Но две ограничения са важни. Общите нива на мутантните белтъци TDP-43 и FUS не намаляват, а проучването не измерва пряко количеството белтъчни агрегати, така че то показва функционално възстановяване, без да доказва отстраняване на агрегатите. Всеки, който следи как обикновено се формулират редокс и митохондриалните хипотези, трябва да приема механизма като подкрепен от данните, но не и окончателно установен.

Моментът на започване е най-показателната подробност. Когато авторите изчакват до 5-ия ден от зрелия стадий, за да започнат третирането, делът на парализираните на 12-ия ден е около 55 процента, вместо около 10 процента при третиране от излюпването. Същото вещество, същият червей, същата мутация, но много по-малък ефект. Ранната профилактична експозиция обяснява голяма част от наблюдаваната полза.

Нулевият резултат: какво показва проучването при мишки със SOD1

Проучването при мишки от 2011 г. поставя по-труден въпрос в по-строга система. При конгенните мишки със SOD1 G93A заболяването напредва от тремор на задните крайници през нарушения в походката и загуба на рефлекса за изправяне до предварително определена терминална крайна точка. Третирането започва преди появата на симптоми, на 45-ия ден, и продължава ежедневно, като наблюдателите оценяват неврологичното състояние по скала от 0 до 6. Това е експеримент, проследяващ целия ход на заболяването, което го доближава повече до важните за пациента въпроси, отколкото която и да е крива на парализата при червей.

Основните резултати са нулеви. Общата поява на симптоми настъпва на 121 дни при контролите спрямо 124 дни при метиленово синьо — разлика, която не е значима. Преживяемостта до крайния стадий е 167 дни спрямо 170 дни, също без значима разлика. Няколко вторични анализа са в полза на третирането: при женските се наблюдава забавяне на появата на симптоми с около 7 дни, а третираните животни прекарват малко повече време в по-леките стадии и по-малко в тежките. При малки подгрупи по пол и многобройни сравнения между стадиите тези резултати по-скоро пораждат хипотези, отколкото служат като доказателство. Не са измерени броят на невроните, агрегацията на SOD1 или маркери за оксидативен стрес и възпаление, така че проучването не може да установи и дали веществото е достигнало своите мишени, но не е подействало, или просто изобщо не е взаимодействало с тях при тази доза. Изследвана е само една доза.

Самите автори подчертават най-същественото ограничение, което важи и в двете посоки. Моделите с голям брой копия на SOD1 G93A възпроизвеждат добре заболяването, обусловено от токсичен SOD1, но то представлява малка част от фамилната АЛС и има различна биология от повечето спорадични случаи. Те предлагат кандидатните вещества да бъдат изследвани отново в модели при бозайници, основани на TDP-43. Оттогава това предложение става по-сложно, защото авторите на проучването при червеи и риби отбелязват, че отделно проучване на метиленово синьо при мишки с TDP-43 също не е показало подобрение на двигателните показатели. Следователно едно съединение може да изглежда силно действащо в една система с TDP-43 и без ефект в друга система с TDP-43. Системата е също толкова важна, колкото генът.

Защо подобрението при червей или риба не може да установи полза при пациенти

Разглеждайте всеки модел като отговор на различен въпрос.

Първо, биологията се различава. TDP-43 и FUS са белтъци, свързващи нуклеинови киселини, с общи генетични взаимодействия в тези прости системи, докато токсичността на SOD1 се осъществява чрез отчасти различни непосредствени механизми. Вещество, което облекчава един вид протеотоксичен стрес, не е задължително да облекчава другия, а успехът срещу свръхекспресията в ембриони не е задължително да предсказва успех срещу бавната невродегенерация при възрастни, съпроводена от възпаление, участие на глията и влошаване на целия организъм.

Второ, експозицията се различава. Непрекъснатата експозиция чрез средата при микромоларни концентрации не е приложение през устата. Чревната абсорбция, метаболизмът при първо преминаване, свързването с плазмените белтъци, проникването в мозъка и клирънсът стоят между погълнатата доза и двигателния неврон в гръбначния мозък. Нито едно от проучванията не измерва нивата на веществото в нервната система, така че нито едно не може да съпостави своята концентрация с тази в другото.

Трето, моментът на започване се различава. Ползите при червеите и рибите зависят силно от третиране преди натрупването на патологични изменения. Третирането при мишките също започва преди симптомите, което е силна страна, но лечението при хора почти винаги би започнало след появата на симптоми, тоест още по-късно. Профилактичният сигнал в двудневен тест с ембриони е отправна точка за изследвания, а не модел на клинична употреба.

Четвърто, крайните показатели се различават. Парализата на 12 дни, чувствителността към алдикарб, дължината на аксоните в микрометри и изминатото при плуване разстояние са непосредствени фенотипни показатели. Появата на симптоми и преживяемостта при бозайник отразяват всички компенсаторни и усложняващи процеси в организма. Лекарствата често променят непосредствените показатели, без да променят преживяемостта, затова се използват крайни показатели за време до събитие при бозайници.

Читателите, които искат контролен списък за следващото заглавие, могат да използват този от как да четем предклинични проучвания: проверете вида, трансгена, дозата и пътя на приложение, дали са измерени нивата на веществото, кога е започнало третирането спрямо патологичните изменения, дали крайният показател е краткосрочен фенотип или ходът на заболяването и дали ефектът е възпроизведен във втора лаборатория. По-широката доказателствена база за метиленовото синьо при хора остава мястото, където да проверите дали някой от тези ранни сигнали е довел до клинични данни.

Какво означава това за пациентите и семействата

От тези публикации не следва установен протокол за метиленово синьо при АЛС. Положителното проучване подкрепя по-нататъшни изследвания на оксидативните и синаптичните механизми в биологията на TDP-43 и FUS. Нулевото проучване дава основание да не се очаква промяна в хода на заболяването при продължително приложение през устата с тази експозиция при заболяване от типа SOD1. Заедно те описват несъответствие между моделите, а не препоръка за лечение.

Безопасността заслужава същия трезв подход като ефикасността. Проучванията на АЛС при мишки не казват нищо за безопасното дозиране при хора, а метиленовото синьо носи реални рискове от хемолиза при дефицит на G6PD и от серотонинова токсичност при комбиниране със серотонинергични лекарства. Подозрението за дефицит на G6PD, текущата употреба на антидепресанти и всяка планирана промяна в лекарствата трябва да се обсъдят с лекар, както и общите данни за безопасността на метиленовото синьо, преди някой да предприеме действия въз основа на заглавия за лабораторни резултати.

Изводът се побира в едно изречение. Метиленовото синьо води до изразено възстановяване на фенотипните показатели при ранна експозиция в модели с TDP-43 и FUS при червеи и риби в ларвен стадий, но практически не носи полза за появата на симптоми или преживяемостта в проучване при мишки със SOD1 с продължително приложение през устата, така че коректното тълкуване е за зависими от модела доказателства, които не подкрепят употребата при пациенти.