Кой разработи пурпурното оцветяване на кръвни натривки? Метиленово синьо, Малаховски, Романовски и Гимза

Еозинът е червен. Метиленовото синьо е синьо. Смесете двете, нанесете сместа върху изсушена кръвна натривка и части от нея ще се оцветят в пурпурно.

Не всички части. В добре приготвен препарат ядрата на белите кръвни клетки придобиват червено-пурпурен цвят, а хроматинът в маларийния паразит се оцветява по същия начин, докато околните червени кръвни клетки остават розови, а цитоплазмата — сиво-синя. Именно пурпурният цвят позволява да се разграничават типовете клетки.

Нито една от бутилките не съдържа пурпурно багрило. Цветът се появява само когато определен продукт от разграждането на метиленовото синьо се срещне с еозина върху предметното стъкло, а през 1880-те и 1890-те години никой не знае, че този продукт съществува, камо ли какво представлява. Хората, които търсят този цвят, работят сами, с нечисти багрила и без надежден начин да установят какво има в една бутилка, след като е престояла два месеца на рафта.

Затова въпросът в заглавието има повече от един защитим отговор и затова отговорът се променя през 2011 г.

Какво се вижда според състава на сместа

Оцветяването не е изобретено наведнъж. То се развива постепенно. Всяка промяна в сместа добавя точно един нов елемент видима информация и последователността на тези елементи е най-ясният начин да се проследи историята.

Важна е закономерността в последната колона. Всяка стъпка напред разширява цветовата гама, а всяко разширяване прави видима още една структура. Пурпурният цвят не е украса към техниката; той е разликата между това да видите, че има паразит, и това да видите от какво е изграден. Как самото багрило излиза от багрилен завод на BASF и навлиза в медицината е по-дълга история със свои собствени документи. Пълната последователност по-горе, с източника за всеки запис, е събрана в хронология на участниците с връзки към източниците.

Фигура: същите шест смеси, изобразени чрез съдържанието на съда и получения резултат. Кръговете показват багрилата, а блоковете под тях — цветовете, които тези багрила могат да дадат в кръвна натривка. Преди 1890 няма червено-пурпурен блок, а след това той присъства навсякъде.

Човекът, който използва боракс целенасочено

Ернст Малаховски е лекар в Бреслау, днешен Вроцлав, който прекарва професионалния си живот в частна практика и в малка клиника, управлявана заедно с колега, а лабораторната работа върши в свободното си време. Роден е в Стшелно на 12 март 1857 г., учи медицина в Университета в Бреслау и от 1882 до 1887 г. работи като асистент по вътрешни болести в болницата „Вси светии“, тогава втората по големина болница в Германия.

Започва през 1888 г. с двойното оцветяване на Хенчински и Плен. В препарат, приготвен през 1889 г., вижда, че хроматинът в ядрото на плазмодия се оцветява различно от цитоплазмата, но после установява, че не може да възпроизведе резултата. Опитва да подкисели метиленовото синьо, което влошава нещата. Опитва да го алкализира с боракс и това сработва всеки път. Демонстрира метода публично на 15 юни 1890 г. и публикува по-пълно описание през август 1891 г., включително указанието за боракса. Отбелязва, че оцветяването отнема двадесет и четири часа и че резултатите се възпроизвеждат лесно.

Двадесет и четири часа са много време за диагностична лаборатория, а статията му не се спира подробно на пурпурно-червения цвят на ядрото на паразита. Каквато и да е причината, никой не подхваща целенасоченото алкализиране на метиленово синьо, докато Нохт не го прави отново през 1898 г. Малаховски никога повече не пише за оцветяването на кръв.

Причината до неотдавна да се знае толкова малко за него е в архивите, а не в някаква загадка. В медицинската литература почти не остава следа от живота му, а оцелялото достига до нас по един-единствен път. Дъщеря му Мари напуска Германия и заминава за Лондон през 1939 г., служи в британската армия и се установява в Канада, а колекцията ѝ от семейни документи в крайна сметка попада в Института „Лео Бек“ в Ню Йорк. Брат ѝ Лео загива през Първата световна война. Сестра ѝ Ева е депортирана от Бреслау в транзитния лагер Избица през април 1942 г. и никога не се завръща. Майка ѝ Хедвиг отнема живота си на 22 април 1942 г., вместо да чака същата депортация. Малаховски умира през 1934 г., преди всичко това.

Семейна история, която завършва така, е семейна история, която престават да цитират. Двете статии, които връщат Малаховски в историята на разработването на оцветяването, и двете публикувани през 2011 г., са съставени въз основа на архивни документи в Познан и Вроцлав и на документите на Мари в Ню Йорк.

Една плесенясала бутилка и един руснак с късмет

Дмитрий Романовски учи медицина във Военномедицинската академия в Санкт Петербург и работи върху маларията през по-голямата част от професионалния си живот. През 1890 г. публикува метод, който на хартия е почти идентичен с този на Хенчински: непроменено метиленово синьо и еозин, с малко повече еозин.

През септември 1891 г. публикува метода, който го прави известен, а важната подробност е скрита в указанията. Най-добрите му резултати идват от предварително приготвения разтвор на метиленово синьо — запасен разтвор, престоял повече от два месеца, върху който се е развила плесен. Плесента и продължителният престой са довели до частично деметилиране на багрилото. Романовски не знае това и не може да го контролира, а другите изследователи, които опитват метода му, не успяват да получат пурпурния цвят. Дисертацията му е представена в Санкт Петербург през юни 1891 г., затова общоприетият разказ посочва 1891 г. като година на откритието.

Демонстрацията на Малаховски е през юни 1890 г., повече от година по-рано, а методът му работи целенасочено.

Защо оцветяването получава името на грешния човек

Аргументите в полза на Малаховски са събрани от Кристин Крафтс, Ернст Хемпелман и Барбара Олексин и се основават на четири неща. Датата на публичната демонстрация — юни 1890 г. срещу септември 1891 г. Думата целенасочено срещу думата случайно. Фактът, че Малаховски публикува метода си, включително боракса, докато методът на Романовски зависи от неконтролирана променлива. И наблюдението, че описанието на ядрото на плазмодия, заедно с пурпурния цвят, който го разкрива, на практика изчезва от литературата за седем години, защото никой не може да възпроизведе случайния вариант.

Те изразяват заключението си без заобикалки. В биографичната статия наричат приписването на заслугата „пародия“ и цитират Ралф Лили, който през 1978 г. пише, че „може би трябва да наричаме тази група оцветявания оцветявания по Малаховски“.

Претенцията е оспорвана, както обикновено се случва с претенциите за първенство, и си струва да се обясни естеството на спора, вместо той да се разрешава. Спорът за първенство трябва да уточни какво е откритието. Ако откритието е пурпурният цвят, Малаховски има по-ранната документирана демонстрация. Ако откритието е публикуваният метод, и двамата публикуват през 1891 г., а оцветяването получава името на Романовски. Ако откритието е обяснението, нито един няма основание за претенция, защото нито един не знае, че узряването е деметилиране, и нито един не може да обясни защо изобщо се появява цветът. Именно тази последна подробност популярните разкази пропускат. Активната съставка е примес, който никой не е идентифицирал, а първият човек, получил цвета целенасочено, го постига чрез възпроизводима емпирична рецепта, а не чрез разбиране на това какво прави рецептата.

Двете статии от 2011 г. са най-пълното публикувано изложение на аргументите в полза на Малаховски и двете могат да се прочетат безплатно чрез PubMed: подробният обзор на PMID 21235291 и биографичната статия на PMID 21660627. Записът за обзора в PubMed посочва и коментар към него, публикуван в същото списание по-късно същата година на 86(5):366 — уместно напомняне, че аргументите са оспорени в печата веднага след появата им.

Това, което спорът не представлява, е разногласие за химията. Всички участници са съгласни какво е пурпурният цвят и кои компоненти го пораждат. Разногласието е кой пръв е стигнал до него и дали случайност, която никой не може да повтори, изобщо се брои за достигане до резултата.

Какво добавят по-късните имена

Ако Малаховски пръв получава пурпурния цвят, защо оцветяването носи имената на Романовски, Райт и Гимза?

Защото оцветяваща смес, която работи веднъж в ръцете на своя създател, не е реактив. По-късната работа превръща капризната смес в нещо, което лаборант в друга държава може да използва в един обикновен вторник.

Нохт стига до резултата чрез разсъждение. След като не успява да получи надежден резултат с обикновено неутрално багрило, заключава, че пурпурният цвят трябва да идва от нещо в метиленовото синьо, което не е метиленово синьо, и започва да го търси. Уна вече е забелязал, че престоялите разтвори на метиленово синьо оцветяват гранулите на мастоцитите в червено, и е предположил, че при узряването на багрилото се образува ново вещество. През 1885 г. Бернтсен е показал, че алкалните условия отстраняват метилови групи от метиленовото синьо и че получените продукти са това, което днес наричаме азури. Нохт екстрахира активната фракция с хлороформ и може да я нарече единствено червено от метиленово синьо; Михаелис я назовава азур I през 1901 г. Дженър решава практическата страна. Повторното разтваряне на утайката от метиленово синьо и еозин в абсолютен метанол дава един стабилен разтвор, който фиксира натривката едновременно с оцветяването и премахва нуждата от топлинна фиксация. Лайшман и Ройтер съчетават полихромирано багрило с алкохолен разтворител и постигат едновременно стабилност и пурпурен цвят. Райт заменя дванадесетчасовата инкубация при 65 °C и десетдневния престой с един час в поток от пара. Гимза изобщо престава да разчита на случайно узрял разтвор, като използва отмерени количества известни багрила с глицерол в метанола, за да може продуктът да издържа на тропическата жега. Той никога не публикува как получава чист метиленов азур. Продава го на лабораторията на д-р Грюблер в Лайпциг, която го предлага като азур I и твърди, че само нейният вариант е автентично багрило на Гимза.

За идентичността на този азур все още се спори. Според някои той е просто полихромирано метиленово синьо, а според други е богат на Azure B. Отговорът идва вследствие на война. Когато германските багрила стават недостъпни, екип от Службата за обществено здраве на Съединените щати — Ралф Лили с Морис Роу и Ейми Уилкокс — установява, че най-доброто оцветяване се получава от три отделени компонента: немодифицирано метиленово синьо, неговия деметилиран продукт на разграждане Azure B и еозин. Azure B заменя недостъпния азур I и тези три компонента все още са основата на оцветяването, използвано днес за диагностициране на малария.

Химията на взаимодействието между тези три компонента върху предметното стъкло е отделен въпрос и тема на друга страница. Ролите на багрилата и химията на оцветяванията от типа на Романовски разглежда какво правят Azure B и еозинът поотделно и защо двойката дава цвят, който нито едно не дава самостоятелно. Страницата за микроскопия и лабораторни приложения разглежда практическата страна: какво показва даден препарат и как да прецените дали определен продукт е подходящ за метода, който възнамерявате да използвате.

Частта от историята, която остава актуална

Една подробност в тази история не престава да бъде вярна през 1902 г. В продължение на приблизително петдесет години най-важният компонент на стандартното оцветяване за малария в света е примес без име. Той присъства случайно, количеството му варира между бутилките, през част от това време идентичността му е търговска тайна, а съотношението му е предмет на спорове до 1940-те години. Хората, които използват оцветяването, не са небрежни. Те нямат начин да знаят какво има в бутилката.

Съвременният вариант на същия проблем е спецификация, която описва само част от материала. Съответствието с USP е пътят към най-високата чистота, предлагана на пазара, защото това е пълен публикуван стандарт, а не единично измерване: идентичност, чистота, органични примеси, включително азурните багрила, остатъчни разтворители, елементни примеси, остатък след накаляване, микробиологични граници и бактериални ендотоксини. Blupreme получава метиленовото си синьо от фармацевтичен производител и публикува пълния сертификат за анализ, така че всеки ред от този списък да може да бъде проверен, а не просто заявен. Сертификат, който посочва резултат за тежки метали и го нарича съответствие с USP, е съвременният еквивалент на бутилка с етикет „узряло метиленово синьо“: възможно е да е отличен реактив, но етикетът не ви казва какво има в него.