Метыленавы сіні пры пашкоджанні галаўнога мозгу: як разумець даклінічныя доказы

Удар па галаве, закаркаваная артэрыя і павольнае нейрадэгенератыўнае захворванне могуць прывесці да адной і той жа праблемы: мозгу больш не хапае энергіі для сваёй працы. Менавіта гэты агульны канчатковы вынік тлумачыць, чаму адно злучэнне зноў і зноў з'яўляецца ў літаратуры па ўсіх трох кірунках. Але агульны вынік не азначае агульную канцэпцыю. Увядзенне прэпарату да пашкоджання, увядзенне на працягу гадзіны пасля яго і ацэнка вынікаў праз месяцы правяраюць розныя ідэі, нават калі ў шпрыцы тая самая сіняя вадкасць.

Гэты артыкул разглядае частку гэтай літаратуры, прысвечаную пашкоджанням. Ён тлумачыць, што азначае выкарыстанне метыленавага сіняга пры пашкоджанні мозгу ў эксперыментах на жывёлах, адрознівае траўматычнае пашкоджанне ад інсульту і хранічнай нейрадэгенерацыі і паказвае, чаму час увядзення дозы тлумачыць большасць адрозненняў паміж даследаваннямі.

Тры пашкоджанні, адзін энергетычны збой

Механізм, які звязвае гэтыя мадэлі, знаходзіцца ў мітахондрыях. У норме электроны праходзяць па электрон-транспартным ланцугу, забяспечваючы выпрацоўку ATP, а спраўны ланцуг утрымлівае ўтварэнне актыўных формаў кіслароду пад кантролем. Пасля пашкоджання часткі ланцуга пачынаюць працаваць са збоямі, выпрацоўка ATP падае, а ўтварэнне свабодных радыкалаў узрастае. Агляд у Molecular Neurobiology за 2018 год апісвае метыленавы сіні як альтэрнатыўны пераносчык электронаў: ён прымае электроны ад NADH і перадае іх цытахрому c, што павышае актыўнасць комплексу IV і аднаўляе сінтэз ATP нават пры пашкоджанні пачатковай часткі ланцуга.

Прыведзеныя лічбы канкрэтныя. У прэпаратах клетак і тканкавых зрэзаў актыўнасць комплексу IV павялічвалася на 30–100 працэнтаў, а спажыванне кіслароду ўзрастала адпаведна. Гэта сведчыць, што дадатковыя электроны выконвалі карысную працу, а не ўцякалі з ланцуга з утварэннем радыкалаў. У мадэлі інсульту ў пацукоў выпрацоўка ATP у пашкоджанай вобласці праз 24 гадзіны пасля ўвядзення была прыкладна на 30 працэнтаў вышэйшай, чым у жывёл без увядзення прэпарату. Агляд у Biochemistry (Moscow) за 2022 год дадае наступныя эфекты: менш акісляльнага стрэсу, нейразапалення і апаптозу, а таксама ўплыў на монаамінаксідазу, сінтазу аксіду азоту, мітахандрыяльны біягенез, аўтафагію і агрэгацыю няправільна згорнутых бялкоў.

Такім чынам, канцэпцыя простая. Пашкоджанне перакрывае звычайны шлях электронаў, а метыленавы сіні прапануе абыходны маршрут. Усё далейшае залежыць ад таго, якое гэта пашкоджанне, калі ўводзяць прэпарат і як вымяраюць вынік.

Траўматычнае пашкоджанне — не інсульт

У мадэлі чэрапна-мазгавой траўмы (TBI) сіла дзейнічае раптоўна. Першаснае пашкоджанне механічнае: тканкі разрываюцца, сасуды лопаюцца, а гематаэнцэфалічны бар'ер губляе цэласнасць за лічаныя хвіліны. Метыленавы сіні патэнцыйна можа ўздзейнічаць на наступную, другасную хвалю, якая развіваецца на працягу гадзін і дзён: мітахондрыі ў ацалелых тканках перастаюць нармальна працаваць, запаленне распаўсюджваецца, а ацёк нарастае. Канчатковыя паказчыкі ў гэтых даследаваннях адлюстроўваюць такую паслядоўнасць: аб'ём ачага пашкоджання, утрыманне вады ў мозгу, выжыванне нейронаў паблізу месца ўдару і пазнейшыя паводзінскія паказчыкі, напрыклад аднаўленне рухаў або навучанне ў лабірынце.

У мадэлі інсульту або глабальнай ішэміі характар пашкоджання іншы. Крывацёк спыняецца, праз некалькі хвілін узнікае энергетычны збой, а аднаўленне крывацёку прыносіць уласнае рэперфузійнае пашкоджанне. Тут увядзенне прэпарату прывязваюць да сасудзістай падзеі, часта ў межах некалькіх хвілін пасля аклюзіі або рэперфузіі, а канчатковыя паказчыкі колькасна ацэньваюць лёс тканак у вострым перыядзе — ад некалькіх гадзін да аднаго-двух дзён: памер інфаркту, крывацёк і ранняе функцыянальнае аднаўленне. Адзін з падыходаў у літаратуры пра інсульт — папярэдняе ўвядзенне прэпарату жывёлам да аклюзіі сасуда. Гэта правярае прафілактыку такім спосабам, які ў эксперыменце з траўмай галавы нельга этычна паўтарыць на людзях.

Вынікі даследаванняў інсульту — найбольш пераканаўчыя ў літаратуры пра пашкоджанні, і сярод іх ёсць найбольш выразны нулявы вынік. У пацукоў, якім метыленавы сіні ўводзілі пры рэперфузіі пасля адной гадзіны аклюзіі сярэдняй мазгавой артэрыі, на 2-і дзень інфаркты былі на 30 працэнтаў меншыя, а большая частка ядра і пенумбры, якім пагражала незваротнае пашкоджанне, была захаваная (Shen, 2013). Даследаванне пастаяннай аклюзіі выявіла больш павольны пераход тканак пад пагрозай у інфаркт, але не выявіла памяншэння канчатковага аб'ёму інфаркту праз 24 гадзіны ні пры адной з дзвюх правераных доз (Rodriguez, 2014). У трэцім даследаванні аклюзіі сярэдняя доза паменшыла памер інфаркту прыкладна ўдвая; ультраструктуру мітахондрый і мітафагію дакументавалі непасрэдна ў ішэмічным мозгу. Пры гэтым паведамлялася пра нечаканую дэталь: вымераны апаптоз узрастаў, а некроз змяншаўся (Di, 2015). Пры глабальнай ішэміі бесперапынная інфузія нізкай дозы аднаўляла актыўнасць цытахром-c-аксідазы, узроўні ATP і патэнцыял мітахандрыяльнай мембраны ва ўразлівай вобласці CA1 гіпакампа, захоўвала гэтыя нейроны і абараняла прасторавую памяць (Lu, 2016). На вымярэннях у CA1 варта спыніцца: гэта прамыя даныя пра ATP і дыхальны ланцуг знутры пашкоджанага мозгу, тады як у літаратуры пра TBI пра іх пераважна мяркуюць, а не вымяраюць.

Хранічная нейрадэгенерацыя адрозніваецца ад абодвух выпадкаў. У мадэлях хвароб Альцгеймера, Паркінсана і Хантынгтана прэпарат уводзяць жывёлам на працягу тыдняў або месяцаў і вымяраюць агрэгацыю бялкоў, абмен дафаміну або паступовае пагаршэнне кагнітыўных функцый. Гэтыя паказчыкі амаль не маюць нічога агульнага з ачагом пашкоджання, вымераным праз некалькі дзён пасля ўдару. Чытачы, якія пераносяць вынік з аднаго кірунку ў іншы, пераносяць выснову праз мяжу, якой самі эксперыменты ніколі не пераходзілі. Наш агляд літаратуры пра нейрадэгенерацыю разглядае гэтыя доўгатэрміновыя даследаванні ў іх уласным кантэксце, а параўнанне з доказамі толькі па інсульце падрабязна адрознівае схемы з закаркаваннем сасудаў ад схем з ударам.

Што насамрэч рабілі ў мадэлях TBI

Ніводнае выпрабаванне метыленавага сіняга пры чэрапна-мазгавой траўме ў людзей не было апублікавана. Усе даныя па TBI атрыманы на жывёлах, пераважна пацуках і мышах, і засяроджаны вакол невялікага набору эксперыментаў. Іх варта назваць, бо адрозненні ў дэталях часта губляюцца ў абагульненнях.

У самым раннім даследаванні з кантраляваным ударам па кары пацукам уводзілі 1 mg/kg унутрывенна праз адну гадзіну пасля лёгкага ўдару, затым 0.5 mg/kg праз тры гадзіны (Watts, 2014). На працягу двух тыдняў назірання аб'ём ачага пашкоджання паводле MRI заставаўся меншым у жывёл, якім уводзілі прэпарат. Колькасць памылковых пастановак лап у тэсце хады значна зніжалася ў дні 1, 2 і 7, але не на 14-ы дзень. Пры мікраскапіі на 14-ы дзень у пашкоджанай кары налічвалі 270 дэгенеруючых нейронаў супраць 368 у полі зроку, а выпадкаў анамальнага афарбоўвання па Ніслю — 41 супраць 73. Іншымі словамі, назіралася ранняя абарона, але перавага ў паводзінскіх паказчыках слабела да другога тыдня.

У мадэлі дыфузнага пашкоджання ў мышэй выкарыстоўвалі вадкасна-перкусійны ўдар па сярэдняй лініі і аднаразовае ўнутрывеннае ўвядзенне 2 mg/kg на працягу паўгадзіны (Fenn, 2015). У жывёл, якім уводзілі прэпарат, назіралі менш выяўленую экспрэсію генаў запалення, менш мікрагліі з запаленчым фенатыпам, менш відавочны ацёк і адсутнасць дэпрэсіўнападобных паводзін на 7-ы дзень. Не менш важныя і нулявыя вынікі: сама траўма толькі нязначна павялічвала ўтрыманне вады ў мозгу, а метыленавы сіні не прадухіляў страты масы цела і не ліквідаваў парушэнняў каардынацыі рухаў. Супрацьзапаленчы эфект — не тое самае, што поўная абарона.

Два даследаванні на мышах выкарыстоўвалі аднолькавую схему — 1 mg/kg праз адну гадзіну, 0.5 mg/kg праз шэсць гадзін, затым штодзённае ўвядзенне на працягу трох дзён — і пашырылі разуменне механізму. У мадэлі ўдару па кары ўвядзенне прэпарату памяншала аб'ём ачага пашкоджання праз 24 гадзіны, 72 гадзіны і на 14-ы дзень, адначасова захоўваючы нейроны і павышаючы маркеры аўтафагіі (Zhao, 2016). У вадкасна-перкусійнай мадэлі яно памяншала апаптоз нейронаў, зніжала павышаную пранікальнасць гематаэнцэфалічнага бар'ера і паляпшала неўралагічныя ацэнкі на працягу двух тыдняў (Shen, 2019). Аднак у даследаванні Zhao праз 72 гадзіны не было адрозненняў ва ўтрыманні вады ў мозгу, а ў даследаванні Shen не было адрозненняў у тэсце на стрыжні, які круціцца, у дні 1 і 3. Паказчыкі ачага пашкоджання і выжывання клетак змяняліся; ацёк і раннія рухальныя паказчыкі не заўсёды змяняліся разам з імі.

Асабліва вылучаецца па часе ўвядзення эксперымент з адкладзенай дозай (Watts, 2016). У той жа мадэлі ўдару першую дозу ўводзілі толькі праз 24 гадзіны пасля траўмы. Да 2-га дня ў групе адкладзенага ўвядзення назіралася памяншэнне ачага пашкоджання, супастаўнае з вынікам у жывёл, якія атрымалі прэпарат у першыя гадзіны; памяншэнне захоўвалася ў дні 7 і 14. Паводзінскі сігнал быў слабейшы: паляпшэнне ў тэсце памылковай пастаноўкі лап у групе адкладзенага ўвядзення было статыстычна нязначнай тэндэнцыяй. Адна лабараторыя, адна мадэль, адно 24-гадзіннае акно. Гэта сапраўдны доказ таго, што акно выходзіць за межы першых гадзін, але гэта таксама ўвесь доказ гэтага сцвярджэння. Варта заўважыць пастку ў слове «адкладзеная» ў іншых працах: у расійскай серыі даследаванняў, назвы якіх адсылалі да адкладзенай нейрапратэкцыі, прэпарат уводзілі праз 30 хвілін, а слова «адкладзеная» азначала доўгатэрміновыя вынікі, а не позні пачатак увядзення.

Меншае даследаванне факальнага пашкоджання ў пацукоў дапаўняе карціну часу ўвядзення з іншага боку: і ўвядзенне непасрэдна перад траўмай, і ўвядзенне праз 30 хвілін пасля яе памяншалі парушэнні функцый канечнасцяў (Stelmashook, 2019). Папярэдняе ўвядзенне працуе ў лабараторыі менавіта таму, што лабараторыя прызначае час траўмы.

Тут важная дысцыпліна ў інтэрпрэтацыі доз. Агляды апісваюць нізкія дозы як стымулюючыя мітахандрыяльнае дыханне, а высокія — як прыгнятальныя. Гэта тая самая двухфазная залежнасць, якая назіраецца ў фармакалогіі метыленавага сіняга. Таму вынікі нельга чытаць як «больш сіняга — лепшае аднаўленне». Кожнае даследаванне правярае адну кропку на крывой. Тлумачэнне залежнасці эфекту ад дозы прасочвае гэтую крывую ў розных мадэлях, а профіль бяспекі і пабочных эфектаў разглядае, што адбываецца пры больш высокіх дозах.

Прачытайце табліцу па радках: адно і тое ж злучэнне, тры розныя часавыя шкалы. Прафілактыка належыць да сярэдняга радка, неадкладнае лячэнне — да першых двух, а аддаленыя вынікі — да першага і трэцяга.

Прафілактыка, неадкладнае лячэнне, аддаленыя вынікі

Сцвярджэнне пра прафілактыку прасцей за ўсё зразумець няправільна. У мадэлях ішэміі жывёлы, якім прэпарат уводзілі да аклюзіі сасуда, мелі лепшыя вынікі. Часам гэта цытуюць так, быццам метыленавы сіні абараняе любы мозг ад любога будучага пашкоджання. Вынік гэтага не паказвае. Ён паказвае, што мітахондрыі, загадзя падрыхтаваныя альтэрнатыўным шляхам пераносу электронаў, лепш пераносяць запланаванае спыненне крывацёку. Ніхто не плануе траўму галавы.

Большасць доказаў па TBI датычыцца неадкладнага лячэння. Увядзенне ў першыя гадзіны пасля ўдару накіравана на каскад другаснага пашкоджання, пакуль ён яшчэ развіваецца: энергетычны збой, акісляльны стрэс, запаленне, ацёк. Паляпшэнні паказчыкаў ачага пашкоджання і ацёку тут з'яўляюцца сапраўднымі эфектамі лячэння, але гэта лячэнне працэсу, а не аднаўленне разарванай тканкі.

Аддаленыя вынікі — трэцяя канцэпцыя. Паводзіны, ацэненыя праз некалькі тыдняў пасля траўмы, або абмен бялкоў, вымераны праз некалькі месяцаў у дэгенератыўнай мадэлі, адказваюць на пытанне, ці захавалася ранняя абарона або ці змяніўся ход павольных працэсаў. Меншы ачаг пашкоджання праз 24 гадзіны, статыстычна нязначная паводзінская тэндэнцыя пасля першай дозы, адкладзенай на 24 гадзіны, і паляпшэнне ў лабірынце праз некалькі месяцаў працяглага ўвядзення — гэта тры розныя сцвярджэнні з трыма рознымі патрабаваннямі да доказаў. Пакуль толькі першае адпавядае свайму ўзроўню патрабаванняў больш чым у адным даследаванні.

Чаго гэтыя доказы не могуць паказаць

Кожны прыведзены вышэй вынік мае адну і тую ж мяжу. Мітахондрыі грызуноў рэагуюць на метыленавы сіні спосабамі, якія могуць быць уласцівыя і мітахондрыям чалавека. Але пацук, якому ўнутрывенна ўводзяць дозу праз некалькі хвілін пасля дакладна зададзенага ўдару, — не чалавек, які трапляе ў аддзяленне неадкладнай дапамогі праз некалькі гадзін пасля падзення. Анестэзія, кантраляваная цяжкасць траўмы, маладыя здаровыя жывёлы і кароткі перыяд назірання абмяжоўваюць пераноснасць вынікаў. Даследаванняў метыленавага сіняга пры выбуховай траўме ўвогуле няма, таму тып пашкоджання, найбольш актуальны для чытачоў з ваеннай сферы, мае найменш доказаў.

Тут таксама не прапануецца пералік доз для чалавека. У даследаваннях на жывёлах выкарыстоўваюць унутрывенны і ўнутрыбрушынны шляхі ўвядзення з дозамі, выбранымі для кантролю эксперыменту, а не кроплі для прыёму ўнутр, якія прадаюцца ў розніцу. Нішто ў гэтых даследаваннях не вызначае схему для чалавека, і ніводнае з іх не правярае метыленавы сіні разам са стандартнай дапамогай пры траўме галавы.

Таму сумленнае падсумаванне змяшчаецца ў адным абзацы. У грызуноў метыленавы сіні, уведзены прыкладна ў час траўматычнага або ішэмічнага пашкоджання мозгу, захоўвае выпрацоўку энергіі мітахондрыямі, а за гэтым захаваннем ідуць меншыя ачагі пашкоджання і лепшыя ацэнкі аднаўлення. У адным даследаванні ўдару частка эфекту на ачаг пашкоджання захоўвалася пры першай дозе, адкладзенай на 24 гадзіны. Ці адбываецца нешта з гэтага ў пашкоджаным мозгу чалавека, не праверана, а літаратура па TBI і інсульце правярае розны час увядзення паводле розных канчатковых паказчыкаў. Той, хто прадае ўпэўненасць на падставе гэтых доказаў, дадае інгрэдыент, якога ў эксперыментах ніколі не было.