Метыленавы сіні, таў і амілоід: чаму механізмы выдалення бялкоў адрозніваюцца

Спытайце, што метыленавы сіні робіць з бялкамі пры хваробе Альцгеймера, і вы пачуеце адзін упэўнены адказ там, дзе варта пачуць тры адказы з агаворкамі. У прабірцы ён перашкаджае малекулам таў зліпацца паміж сабой. У адной мышынай мадэлі ён зніжае ўзровень растваральнага амілоіду, не закранаючы таў. У іншай — зніжае актыўнасць ферменту, які ўвогуле ўтварае амілоід. Кожны з гэтых вынікаў рэальны. Ніводны не дае поўнай карціны, і не ўсе яны назіраюцца ў адной жывёлы адначасова. Гэты артыкул размяжоўвае гэтыя тры вынікі, каб вынік аднаго эксперыменту перасталі цытаваць як доказ іншага.

Чытачам, якія хочуць атрымаць шырэйшае ўяўленне пра тое, як метыленавы сіні дзейнічае ўнутры клетак, варта пачаць з таго артыкула. Тым, хто хоча ведаць, ці дапамагло нешта з гэтага пацыентам, варта прачытаць агляд клінічных даных пры хваробе Альцгеймера, дзе і разглядаюцца вынікі выпрабаванняў на людзях. Гэты артыкул не паўтарае той агляд.

Вынік адносна таў датычыцца аналізаў агрэгацыі

Найстарэйшая з трох гісторый паходзіць з бясклетачных даследаванняў таў — бялку, які ўтварае нейрафібрылярныя клубкі. У аналізе звязвання таў–таў фрагменты таў збіраюцца ў парныя спіральныя філаменты, а фенатыязінавыя фарбавальнікі, у тым ліку метыленавы сіні, блакуюць гэтае ўтварэнне пры нізкіх мікрамалярных канцэнтрацыях. Пазнейшыя біяхімічныя даследаванні далі гэтаму хімічнае тлумачэнне: фарбавальнік акісляе цыстэінавыя рэшткі таў, што стабілізуе манамерную форму і прыгнятае ўтварэнне фібрыл, якія інакш працягвалі б расці. Паведамленыя канцэнтрацыі, якія інгібіруюць агрэгацыю таў, знаходзяцца прыблізна ў дыяпазоне ад адназначных значэнняў да ніжніх дзясяткаў мікрамоляў на літр — гэты дыяпазон важны для ўсяго, што разглядаецца далей.

Звярніце ўвагу, што менавіта сцвярджаецца. Тут нічога не гаворыцца пра ўтварэнне таў, фасфарыляванне таў у жывым мозгу або выдаленне таў. Гаворыцца толькі, што ў вызначаных умовах у прабірцы акіслены фарбавальнік перашкаджае малекулам таў збірацца разам. Гэта дакладны, вузкі і карысны вынік. Праблемы пачынаюцца, калі яго пашыраюць да агульнага сцвярджэння, што метыленавы сіні ліквідуе паталагічныя змены таў, бо даныя на жывёлах не пацвярджаюць такую версію.

Вынік адносна пратэасомы датычыцца мышэй 3xTg-AD і паказвае розніцу паміж амілоідам і таў

Эксперымент, які найбольш выразна паказвае разыходжанне паказчыкаў, — гэта 16-тыднёвае даследаванне ўвядзення з кормам у мышэй з трыма мутацыямі, звязанымі з хваробай Альцгеймера. З шасцімесячнага ўзросту жывёлы елі корм з метыленавым сінім, а даследчыкі адначасова вымяралі тры рэчы: актыўнасць пратэасомы, узроўні амілоіду і паказчыкі таў.

Актыўнасць пратэасомы змянілася. Хіматрыпсінападобная актыўнасць вырасла прыблізна на чвэрць, а трыпсінападобная — прыблізна напалову, тады як трэцяя каталітычная актыўнасць істотна не змянілася. Узроўні растваральнага амілоіду-бэта 40 і 42 знізіліся прыкладна на чвэрць кожны. Аўтары вытлумачылі гэта як узмоцненае выдаленне, а не зніжэнне ўтварэння, бо бялок-папярэднік і фрагменты яго працэсінгу не змяніліся, а навучанне і памяць палепшыліся ў кантрольнай спробе ў водным лабірынце.

Але іншыя паказчыкі разышліся з гэтымі вынікамі. Нерастваральны амілоід не змяніўся. Афарбоўванне бляшак не змянілася. Агульны ўзровень чалавечага таў і таў, фасфарыляванага па трэаніне 181, не змяніўся; парушэнне лакалізацыі таў таксама не змянілася. Мітахандрыяльныя паказчыкі таксама засталіся нязменнымі: не было значнага ўплыву ні на актыўнасць цытахром-c-аксідазы, ні на ўзровень бялку гэтай аксідазы, ні на ATP. Такім чынам, у гэтай мадэлі і пры гэтым рэжыме ўвядзення метыленавы сіні павысіў дзве з трох актыўнасцей пратэасомы, знізіў узровень растваральнага амілоіду, аднавіў паводзінны паказчык і пакінуў нязменнымі паказчыкі таў, нерастваральны амілоід і даследаваныя мітахандрыяльныя паказчыкі.

Адна агаворка не аслабляе, а робіць гэтую выснову больш дакладнай. У гэтых мышэй на момант даследавання яшчэ не ўтварыліся агрэгаты таў, таму эксперымент не можа паказаць, што метыленавы сіні не дзейнічае на клубкі таў. Ён паказвае, што ўзровень растваральнага амілоіду можа зніжацца, тады як вымераныя паказчыкі таў не змяняюцца. Менавіта такі вынік — адзін бялок змяніўся, а іншы не — і патрэбны для разгляду гэтай тэмы. Калі вы лічылі, што актывацыя пратэасомы метыленавым сінім прыводзіць да адначасовага выдалення абодвух характэрных бялкоў, гэтае даследаванне выпраўляе такое ўяўленне.

Вынік адносна ўтварэння амілоіду датычыцца старых мышэй PSAPP і супярэчыць папярэдняму механізму

Іншая група, іншая мадэль і супрацьлеглае тлумачэнне на больш раннім этапе працэсу. У трохмесячным даследаванні ўвядзення праз страўнікавы зонд у 15-месячных мышэй PSAPP штодзённая пероральная доза 3 mg/kg знізіла колькасць бляшак у розных участках мозгу прыкладна на трэць — палову і паменшыла некалькі фракцый амілоіду, у тым ліку алігамеры, вымераныя спецыяльным аналізам. Але тут прапанаваны механізм заключаўся ў зніжэнні ўтварэння, а не ў паскарэнні выдалення: узровень бялку BACE1 у мозгу знізіўся, узровень яго прадукту C99 таксама знізіўся, а матрычная РНК не змянілася. Гэта паказвае на эфект на ўзроўні бялку, а не на зніжэнне экспрэсіі гена.

Даследаванні на клетках узмацнілі гэтае тлумачэнне. У бясклетачным аналізе з рэкамбінантным ферментам метыленавы сіні непасрэдна інгібіраваў BACE1, а ў клетках яечніка хамяка, якія экспрэсавалі чалавечы бялок-папярэднік амілоіду, узровень сакрэтаванага амілоіду 40 і 42 зніжаўся ўжо пры канцэнтрацыях 1.56 мікрамоля на літр, тады як сам папярэднік заставаўся нязменным. Параўнайце гэта з папярэднім даследаваннем, дзе фрагменты працэсінгу папярэдніка не змяніліся, а эфект прыпісалі выдаленню. Абодва вынікі не могуць апісваць адзін і той жа ўніверсальны механізм, бо мадэлі, узрост, дозы, шляхі ўвядзення і працягласць адрозніваюцца. У гэтым і сутнасць. У адных умовах уплыў метыленавага сіняга на амілоід рэалізуецца праз яго ўтварэнне, а ў іншых — праз выдаленне; цытаванне любога з гэтых вынікаў без апісання ўмоў уводзіць у зман.

Адна хімія, некалькі мішэняў: сувязь праз акісленне цыстэіну

Трэці кірунак даследаванняў тлумачыць, як адна і тая ж акісляльна-аднаўленчая хімія можа праяўляцца ў не звязаных паміж сабой гісторыях пра бялкі. У біяхімічным даследаванні інгібіравання каспаз метыленавы сіні інактываваў каспазу-6, акісляючы яе каталітычны цыстэін да сульфенавай кіслаты, што было пацверджана мас-спектраметрыяй; канцэнтрацыя паўмаксімальнага інгібіравання складала каля 10.6 мікрамоля на літр. Каспаза-3 інгібіравалася пры падобнай канцэнтрацыі. Аўтары непасрэдна звязалі гэта з літаратурай пра таў: тая самая хімія акіслення цыстэіну, якая, паводле прапанаванага тлумачэння, утрымлівае таў у манамернай форме, можа выключаць цыстэінавую пратэазу, а эфектыўныя канцэнтрацыі перакрываюцца.

Гэта вытанчанае тлумачэнне, але адначасова і папярэджанне. Акісляльна-аднаўленча актыўная малекула, якая акісляе даступныя цыстэінавыя рэшткі, будзе мець больш за адну мішэнь пры любой актыўнай канцэнтрацыі. Гісторыя пра дэзагрэгацыю таў, гісторыя пра каспазы і, магчыма, іншыя маюць агульнае хімічнае дзеянне, але розныя аб’екты. Гэтае агульнае дзеянне не робіць вынікі ўзаемазаменнымі. Яно азначае, што доза і кантэкст вызначаюць, якая мішэнь мае значэнне, і што працяглае ўвядзенне, накіраванае на адзін цыстэінзалежны працэс, можа закранаць іншыя — аўтары даследавання каспаз непасрэдна адзначылі гэта. Звязаныя пытанні пра тое, як акісляльна-аднаўленчая хімія метыленавага сіняга вызначае яго мішэні, што актывацыя пратэасомы азначае для іншых агрэгаваных бялкоў і ці змяняе працяглае ўвядзенне профіль мішэняў, заслугоўваюць асобнага разгляду.

Механізмы паводле паказчыкаў: які вынік да якой мадэлі адносіцца

Прачытайце табліцу радок за радком, і выснова стане відавочнай. Ніводны радок не паказвае змен ва ўсіх слупках. Найбольш пераканаўчы вынік адносна ўтварэння амілоіду атрыманы ў даследаванні, дзе пратэасому наогул не правяралі. Найбольш пераканаўчы вынік адносна пратэасомы атрыманы ў даследаванні, дзе працэсінг папярэдніка зусім не змяніўся. Вынік адносна таў пераважна абмяжоўваецца прабіркамі і хіміяй, агульнай з ферментамі па-за асноўнай мішэнню. Той, хто аб’ядноўвае гэтыя слупкі ў адно сцвярджэнне — што метыленавы сіні выдаляе паталагічныя бялкі як клас, — піша агляд эксперыменту, які ніколі не праводзіўся.

Такая дакладнасць патрэбная і ў дачыненні да пацыентаў. Ці даюць гэтыя механізмы ў сукупнасці клінічную карысць — асобнае пытанне са сваімі выпрабаваннямі і высновамі. Адказ на яго разглядаецца ў аглядзе клінічных доказаў пры хваробе Альцгеймера, а не тут.