Метыленавы сіні і клетачнае старэнне: тлумачэнне паказчыкаў фібрабластаў

Распаўсюджанае памылковае прачытанне выглядае так. У артыкуле паведамляецца, што метыленавы сіні дадаў больш за 20 падваенняў папуляцыі фібрабластам у культуры, і чытач робіць выснову, што ён выдаляе старэючыя клеткі або ў падобнай ступені падаўжае жыццё чалавека. Такая выснова здаецца натуральнай. Але яна памылковая ў двух асобных аспектах.

Асноўная праблема тут канцэптуальная, а не колькасная. Падваенні папуляцыі, маркеры старэння і вымярэнні тэламер адказваюць на розныя пытанні. Працы пра метыленавы сіні на фібрабластах лепш разглядаць як даследаванні адтэрміноўкі пераходу да старэння ў аднаго тыпу клетак у культуральнай чашцы, падмацаваныя мітахандрыяльнымі вымярэннямі. Гэта адрозніваецца ад выбарачнага выдалення клетак, якія ўжо старэюць, і, у сваю чаргу, ад старэння арганізма. Шырэйшы кантэкст гэтага адрознення разглядаецца ў матэрыяле пра тое, як мітахандрыяльны транспарт электронаў уплывае на энергію клеткі, і ў тлумачэнні таго, як інтэрпрэтаваць сцвярджэнні ў даследаваннях метыленавага сіняга.

Падваенні папуляцыі падлічваюць гісторыю, а не маладосць

Большасць ключавых вынікаў атрымана на клетках IMR90 — нармальным штаме фібрабластаў лёгкіх плода чалавека з абмежаванай рэплікатыўнай здольнасцю. У раннім даследаванні метыленавага сіняга і рэплікатыўнай працягласці жыцця фібрабластаў IMR90 культуры перасявалі паводле раскладу і рэгістравалі сумарную колькасць падваенняў папуляцыі, пакуль культура не спыняла дзяленне. Апрацоўка ў нанамалярным дыяпазоне, пераважна пры 100 nM, дазваляла культурам назапасіць больш за 20 дадатковых падваенняў да спынення дзялення.

Падваенне папуляцыі — гэта адзінка ўліку. Яна паказвае, колькі разоў папуляцыя прыблізна падвоілася. Яна не паведамляе непасрэдна, ці асобная клетка старэе, знаходзіцца ў стане спакою, дыферэнцыяваная або мёртвая. Культура можа назапашваць падваенні таму, што клеткі даўжэй захоўваюць здольнасць дзяліцца, таму, што менш клетак рана спыняюць дзяленне пад уздзеяннем стрэсу, або таму, што ўмовы адбіраюць субпапуляцыю, здольную да праліферацыі. Адзін толькі падлік не дазваляе адрозніць гэтыя шляхі.

Менавіта таму падлік падваенняў спалучаюць з маркерамі. Падлік паказвае, як доўга працягвалася праліферацыя. Маркеры паказваюць, у які стан перайшлі клеткі, што спынілі дзяленне або выжылі.

Даведнік па канчатковых паказчыках: што паказвае кожны маркер

Старэнне ў культуры — гэта фенатып, які вызначаюць на падставе некалькіх незалежных вымярэнняў. Ні адно афарбоўванне або бялок самі па сабе яго не даказваюць.

Спыненне росту са стратай сінтэзу ДНК. Устойлівае спыненне дзялення правяраюць паводле зніжэння ўключэння BrdU або EdU, плоскай марфалогіі і адсутнасці аднаўлення росту пасля паўторнага пасеву. Гэта дазваляе адрозніць спыненне дзялення пры старэнні ад часовага стану спакою.

Бэта-галактазідаза, звязаная са старэннем. Афарбоўванне SA-beta-gal выяўляе лізасомную актыўнасць пры pH каля 6.0. Старэючыя фібрабласты часта даюць станоўчае афарбоўванне па меры павелічэння масы лізасом. Гэты паказчык не спецыфічны, таму яго інтэрпрэтуюць разам з маркерамі праліферацыі і малекулярнымі маркерамі.

Шляхі p16 і p21. p16 дзейнічае праз CDK4 і CDK6 і шлях RB. p21 часта індукуецца праз p53. Павышэнне іх узроўняў сведчыць на карысць спынення дзялення, але ніводны з гэтых бялкоў не ўласцівы выключна старэнню.

Сакраторны стан. Сакраторны фенатып, звязаны са старэннем, або SASP, азначае змененае выдзяленне цытакінаў, хемакінаў, фактараў росту і пратэаз. Аналізы РНК або бялкоў для фактараў SASP апісваюць, як клеткі перадаюць сігналы суседнім клеткам. Яны не вымяраюць рэплікатыўную здольнасць непасрэдна.

Акісляльнікі і мітахандрыяльныя паказчыкі. Працы пра метыленавы сіні дадаюць мітахандрыяльны ўзровень аналізу: колькасць і актыўнасць комплексу IV, спажыванне кіслароду, сінтэз гема, масу мембран, мембранны патэнцыял, ATP і сігналы акісляльнікаў. Яны апісваюць метабалічны стан, які суправаджае адтэрміноўку спынення дзялення. Самі па сабе яны не вызначаюць старэнне, але дазваляюць праверыць прапанаваны механізм. Мадэль акісляльна-аднаўленчага цыклу, у якой NAD(P)H аднаўляе метыленавы сіні, а цытахром c зноў яго акісляе, выкладзена ў тым самым даследаванні IMR90, якое звязвае акісляльна-аднаўленчы цыкл са зніжэннем утварэння акісляльнікаў. Звязаная з гэтым логіка дазавання і размеркавання разглядаецца ў матэрыялах пра фармакалогію метыленавага сіняга і яго ўздзеянне на тканкі.

Хуткасць скарачэння тэламер. Правільная адзінка — колькасць пар асноў, страчаных за адно падваенне на працягу тыдняў, а не даўжыня ў асобны момант часу. Больш павольнае скарачэнне азначае меншае ўкарачэнне пры кожнай рэплікацыі. Гэта не азначае падаўжэння, а стрэс можа спыніць дзяленне клетак IMR90 пры нязначных зменах тэламер.

Параўнанне трох схем даследаванняў фібрабластаў

Арыгінальны матэрыял для гэтай старонкі — параўнанне ніжэй. Яно дазваляе адначасова бачыць тып клетак, уздзеянне, вымярэнні і абмежаванні.

Даследаванне	Клеткі і ўздзеянне	Што вымяралі	Чаго яно не можа паказаць
Atamna і суаўт., FASEB J 2008	Нармальныя фібрабласты IMR90, працяглае ўздзеянне метыленавага сіняга ў нанамалярных канцэнтрацыях, 100 nM як стандартная ўмова	Сумарныя падваенні, утрыманне комплексу IV, павелічэнне спажывання кіслароду на 37–70 працэнтаў, сінтэз гема, прадухіленне заўчаснага старэння, выкліканага пераксідам вадароду або кадміем, ферменты фазы 2 у клетках HepG2	Выдаленне старэючых клетак не правяралася. Няма канчатковага паказчыка працягласці жыцця жывёл або людзей. Рэплікатыўная працягласць жыцця тут азначае падваенні ў культуральнай чашцы.
Atamna і суаўт., Redox Biology 2015, апісана ў наступным механістычным даследаванні AMPK і біягенезу комплексу IV	Фібрабласты IMR90, пераважна 100 nM метыленавага сіняга, з AICAR як сродкам параўнання для працяглай актывацыі AMPK	Дынаміка суадносін NAD і NADH, кароткачасовае фасфарыляванне AMPK, індукцыя PGC-1alpha і SURF1, павелічэнне актыўнасці комплексу IV больш чым на 100 працэнтаў, зніжэнне акісляльнікаў на 28 працэнтаў, больш павольнае скарачэнне тэламер, каля 18 дадатковых падваенняў супраць каля 2 з AICAR, адсутнасць уплыву на клетачны цыкл	AICAR адрозніваецца па дозе прыкладна ў 1000 разоў і па спецыфічнасці, таму параўнанне правярае характар актывацыі, а не дзеянне пры супастаўнай сіле. Вынік па тэламерах датычыцца культур, якія дзяліліся на працягу тыдняў.
Xiong і суаўт., Aging Cell 2016, прадстаўлена ў даследаванні аднаўлення мітахандрыяльных і ядзерных паказчыкаў у фібрабластах пры прагерыі	Першасныя фібрабласты скуры пры прагерыі Хатчынсана — Гілфарда і падабраныя нармальныя кантрольныя клеткі, пераважна 100 nM на працягу 5–12 тыдняў	Форма мітахондрый паводле флуарэсцэнтнай і электроннай мікраскапіі, рухомасць паводле візуалізацыі жывых клетак, супераксід, мембранны патэнцыял, ATP, PGC-1alpha, маркеры праліферацыі і старэння, а таксама выпінанні ядра, лакалізацыя прагэрыну, гетэрахраматын і экспрэсія генаў	Мадэль заўчаснага старэння, спецыфічная для захворвання, а не нармальнае старэнне. Аднаўленне марфалогіі і маркераў — не выдаленне старэючых клетак. Няма ацэнкі эфектыўнасці на жывёлах або клінічнага канчатковага паказчыка.
Агляд Xue і суаўт., Cells 2021, абагульнены ў аглядзе метыленавага сіняга як патэнцыйнага злучэння супраць старэння	Абагульненне літаратуры пра старэнне мозгу, нейрадэгенерацыю, скуру, гаенне ран і прагерыю	Разглядае метыленавы сіні як каталітычны ўдзельнік акісляльна-аднаўленчага цыклу, здольны абыходзіць часткі пераносу электронаў праз комплексы I і III, у кантэксце свабоднарадыкальных тэорый старэння	Толькі апісальнае абагульненне. Яно сістэматызуе гіпотэзы і адзначае, дзе клінічныя даныя застаюцца непераканаўчымі.

Агульная заканамернасць ва ўсіх радках важнейшая за любы асобны радок. Нізкія дозы метыленавага сіняга неаднаразова звязваюцца з даўжэйшым перыядам праліферацыі, больш высокай актыўнасцю комплексу IV, ніжэйшымі сігналамі акісляльнікаў і палепшанай марфалогіяй. Схема застаецца падоўжнай: пачынаюць з клетак, якія дзеляцца, апрацоўваюць іх падчас росту культуры і рэгіструюць, як доўга працягваецца дзяленне. Такая структура можа падтрымаць сцвярджэнне пра адтэрміноўку. Яна не можа падтрымаць сцвярджэнне пра выдаленне без іншай схемы даследавання.

Адтэрміноўка старэння — не выдаленне старэючых клетак

Адтэрміноўка азначае, што клеткі, якія дзеляцца, працягваюць дзяліцца даўжэй, перш чым спыніцца. Выдаленне, якое часта называюць сеналітычным эфектам, азначае, што клеткі, якія ўжо старэюць, выбарачна гінуць або іх колькасць змяншаецца, тады як суседнія клеткі, што праліферуюць, выжываюць.

Літаратура пра метыленавы сіні на фібрабластах правярае першую схему. Культуры спачатку праліферуюць, атрымліваюць апрацоўку падчас паслядоўных перасеваў і пазней дасягаюць спынення дзялення. Таму такія маркеры, як SA-beta-gal, p16, p21 і фактары SASP, з'яўляюцца пазней або маюць ніжэйшыя ўзроўні пры пэўным пасажы. Такая карціна чаканая пры любым зруху моманту пачатку старэння. Яна не даказвае, што была выдалена хоць адна клетка з ужо ўсталяваным станам старэння.

Для сцвярджэння пра сеналітычнае дзеянне спатрэбілася б іншая пастаноўка: спачатку давесці культуру да пацверджанага старэння, затым дадаць злучэнне, а пасля паказаць выбарачную страту гэтых старэючых клетак у параўнанні з кантрольнымі клеткамі, якія праліферуюць, з непасрэднымі вымярэннямі жыццяздольнасці і гібелі. Аднаго зніжэння маркера недастаткова, бо экспрэсія можа змяняцца без страты клетак, а клеткі, якія працягваюць праліфераваць, могуць разрасціся па ўсёй чашцы. Ніводная з чатырох цытаваных крыніц не выкарыстоўвае такую схему выбарачнага змяншэння колькасці клетак для метыленавага сіняга, таму дакладным азначэннем застаецца актыўнасць, якая адтэрміноўвае старэнне або супрацьдзейнічае яму in vitro, а не сеналітычнае дзеянне. Аспект акісляльнага стрэсу ў гэтым адрозненні падрабязней тлумачыцца ў матэрыяле пра тое, як клеткі кантралююць актыўныя формы кіслароду.

Вынік з кароткачасовай сігналізацыяй робіць гэтае адрозненне яшчэ выразнейшым. У працы 2015 года на IMR90 метыленавы сіні выклікаў кароткачасовае павышэнне суадносін NAD і NADH і кароткачасовае фасфарыляванне AMPK, а затым індукцыю PGC-1alpha і SURF1, якія абодва звязаныя з біягенезам комплексу IV. Працяглая актывацыя AMPK з дапамогай AICAR дала значна горшы вынік па дадатковых падваеннях.

Рэплікатыўная працягласць жыцця — не даўгалецце чалавека

Рэплікатыўная працягласць жыцця клетак вызначаецца колькасцю падваенняў да спынення дзялення ў кантраляванай культуральнай чашцы з фіксаванымі ўмовамі па кіслародзе, пажыўным асяроддзі і рытме перасеваў. Даўгалецце чалавека ахоплівае дзесяцігоддзі развіцця, працу імуннай сістэмы, сасудаў, ніш ствалавых клетак, паводзіны і захворванні. Злучэнне можа павялічваць першае, не змяняючы другога, і ў большасці выпадкаў так і адбываецца.

Фібрабласты пры прагерыі нясуць пэўную мутацыю LMNA, якая прыводзіць да ўтварэння прагэрыну; для іх характэрныя фрагментаваныя і менш рухомыя мітахондрыі, нізкі ATP, дэфармаваныя ядры і страта гетэрахраматыну. Метыленавы сіні ў нанамалярных канцэнтрацыях паляпшаў мітахандрыяльныя паказчыкі і істотна аднаўляў ядзерныя паказчыкі, у тым ліку забяспечваў аддзяленне прагэрыну ад мембраны. Гэта прыкметнае аднаўленне на клетачным узроўні. Аднак гэта па-ранейшаму вынік на фібрабластах, і аўтары пазначылі выпрабаванні на жывёлах як будучую працу. Сама мадэль захворвання падрабязней разглядаецца ў матэрыяле пра метыленавы сіні пры прагерыі і ў мадэлях заўчаснага старэння.

З гэтага вынікае практычны кантрольны спіс для чытання.

Высветліце, ці пачалася апрацоўка да спынення дзялення або пасля таго, як яно ўжо ўсталявалася. Апрацоўка да спынення падтрымлівае выснову пра адтэрміноўку. Для высновы пра выдаленне патрэбныя апрацоўка пасля спынення і даныя пра выбарачную гібель.
Высветліце, як выглядала кантрольная крывая падваенняў. Без сумарных падваенняў змены маркераў застаюцца без апоры.
Шукайце прынамсі два класы маркераў, напрыклад метку праліферацыі разам з p16 або p21 і SA-beta-gal, а не толькі адно афарбоўванне.
Высветліце, як былі прадстаўлены даныя пра тэламеры. Хуткасць скарачэння за адно падваенне ў дынаміцы мае сэнс. Адзінкавае вымярэнне даўжыні — не.
Высветліце, што заставалася нязменным. Шчыльнасць пасеву пры перасевах, кісларод, замены пажыўнага асяроддзя і свежыя або старыя зыходныя растворы метыленавага сіняга — усё гэта ўплывае на спыненне дзялення фібрабластаў.

Пры такім прачытанні літаратура пра фібрабласты вызначае для метыленавага сіняга паслядоўную, але абмежаваную ролю: акісляльна-аднаўленча актыўнае злучэнне ў нізкай дозе, якое адтэрміноўвае рэплікатыўнае старэнне культываваных фібрабластаў чалавека і паляпшае мітахандрыяльныя паказчыкі. Найбольш падрабязныя механістычныя даныя датычацца кароткачасовай энергетычнай сігналізацыі і біягенезу комплексу IV, а выдаленне старэючых клетак або падаўжэнне жыцця чалавека ў гэтых працах не прадэманстравана.