Метыленавы сіні і рассеяны склероз: што правяралі ў даследаваннях на жывёлах

Калі шукаць інфармацыю пра метыленавы сіні пры РС, можна знайсці працы, якія нібыта адказваюць на адно і тое ж пытанне. Але гэта не так. У адной працы хворым мышам давалі метыленавы сіні як сродак лячэння. У другой ім не лячылі ніводную жывёлу. Метыленавы сіні выкарыстоўвалі як сіні фарбавальнік для тонкіх зрэзаў спіннога мозгу, каб патолаг мог разгледзець міелін пад мікраскопам.

Гэта ключавая думка ўсяго артыкула. У біялогіі фарбавальнік мае дзве ролі, і агульная ў іх толькі бутэлька. Як патэнцыйны лекавы сродак яго ўводзяць жывой жывёле і правяраюць, ці змяняецца захворванне. Як фарбавальнік яго наносяць на мёртвую фіксаваную тканку пасля эксперымента і высвятляюць, як выглядала тканка. Калі не заўважыць гэтай розніцы, можна прачытаць раздзел пра метады паталагічнага даследавання так, нібы ён апісвае вынік лячэння.

Што такое EAE простымі словамі

Эксперыментальны аўтаімунны энцэфаламіеліт, звычайна скарочана EAE, — стандартная жывёльная мадэль асобных аспектаў рассеянага склерозу. Даследчык імунізуе ўспрымальную мыш фрагментам міелінавага бялку разам з моцным ад'ювантам. Затым імунная сістэма атакуе ўласную цэнтральную нервовую сістэму жывёлы. У мышы развіваецца ўзыходзячая слабасць, якую лёгка ацаніць па шкале ад 0 да 5: ад млявага хваста да паралічу задніх канечнасцяў.

Зручнасць такой ацэнкі тлумачыць і папулярнасць EAE, і тое, чаму гэтая мадэль можа ўводзіць у зман. РС у чалавека ўзнікае самастойна, ахоплівае шырэйшы і менш дакладна вызначаны набор мішэняў і выклікае зрокавыя, сэнсарныя, кагнітыўныя, мозачкавыя і рухальныя сімптомы пры рэцыдыўным або прагрэсавальным цячэнні. EAE узнаўляе асобныя механізмы, такія як запаленне, дэміелінізацыя і пашкоджанне аксонаў, у кантраляваных умовах. Гэта не РС у мініяцюры. Чытачы, якім патрэбнае агульнае ўяўленне, могуць спачатку азнаёміцца з меркаванымі механізмамі дзеяння метыленавага сіняга на клеткавым узроўні, перш чым ацэньваць асобныя сцвярджэнні пра захворванні.

У дзвюх працах ніжэй таксама выкарыстоўвалі розныя антыгены для EAE, і гэта мае значэнне. У даследаванні лячэння захворванне выклікалі з дапамогай MOG35-55 — кароткага пептыду міелінавага алігадэндрацытарнага глікапратэіну. У даследаванні паталогіі захворванне выклікалі з дапамогай MP4 — злітага бялку, які складаецца з сегментаў асноўнага бялку міеліну і пратэаліпіднага бялку. Выбар лініі мышэй і антыгена ўплывае на месца ўзнікнення ачагоў і характар запалення, таму гэтыя дзве працы — не два паўторы аднаго эксперымента.

Схема: ад мадэлі да пытання і абмежаванняў

Трымайце гэтую табліцу перад вачыма. Гэта асноўны арыенцір для артыкула. У кожным радку пазначана, на якое клінічнае пытанне можа адказаць мадэль, што насамрэч вымяралі і дзе заканчваецца магчымасць пераносу вынікаў на чалавека.

Кожны, хто правярае чарговы загаловак, можа выкарыстаць тыя ж слупкі, абапіраючыся на матэрыял пра тое, як чытаць даклінічныя даследаванні: высветліце від жывёлы і антыген, ролю злучэння, канчатковыя паказчыкі і тое, ці апісвае вынік цячэнне захворвання або стан тканкі ў пэўны момант.

Вынік лячэння: што змяніла ўвядзенне рэчыва

У даследаванні лячэння 2016 года ў Journal of Neuroimmunology выкарыстоўвалі самак мышэй C57BL/6 ва ўзросце прыблізна ад 8 да 10 тыдняў, імунізаваных 250 мікраграмамі MOG35-55 на мыш. Пасля індукцыі EAE жывёл выпадковым чынам размеркавалі ў групу метыленавага сіняга або ў групу EAE без лячэння, а клінічныя балы адсочвалі прыкладна да 30-га дня.

З 15-га да 30-га дня клінічныя балы ў мышэй, якія атрымлівалі лячэнне, былі значна ніжэйшыя, чым у кантрольных мышэй з EAE, пры P меншым за 0.01. Аналіз спіннога мозгу паказаў такую ж тэндэнцыю: у жывёл, якія атрымлівалі лячэнне, было менш запаленчай інфільтрацыі, дэміелінізацыі і страты аксонаў.

Адметнай часткай быў набор даследаваных сігнальных паказчыкаў. Лячэнне павялічвала актывацыю AMPK і экспрэсію SIRT1 і падаўляла актывацыю NF-kB — цэнтральнага пераключальніка запалення. З боку адаптыўнага імунітэту яно памяншала адказ Th17 і ўзмацняла адказ Treg. Таму прапанаваны ланцужок выглядае так: метыленавы сіні → AMPK і SIRT1 → зніжэнне сігналізацыі NF-kB → зрух ад запаленчых Th17 да рэгулятарных Treg → менш цяжкае пашкоджанне тканак → ніжэйшыя балы.

Гэты ланцужок — інтэрпрэтацыя, а не даказаная прычынная паслядоўнасць. Даследаванне паказвае, што ўвядзенне прэпарату, змены сігналізацыі і паляпшэнне стану пры захворванні адбываюцца разам. Яно не даказвае, што AMPK і SIRT1 цалкам абумоўліваюць карысны эфект, а агульнадаступны індэксаваны тэкст недастаткова выразна падае дакладную дозу ў міліграмах на кілаграм, шлях увядзення, дзень пачатку і працягласць, каб аднавіць схему толькі з анатацыі. Лічыце любую дозу, прыведзеную ў сувязі з гэтай працай на старонцы продажу, неправеранай, калі яна не абапіраецца на раздзел метадаў поўнага тэксту. У шырэйшай доказнай базе даследаванняў метыленавага сіняга на людзях варта праверыць, ці атрымаў гэты ранні імунны сігнал калі-небудзь працяг у клінічных даных.

Вынік даследавання паталогіі: што паказалі тканкі за шэсць месяцаў

У даследаванні MP4 2015 года ў PLoS ONE выкарыстоўвалі самак мышэй C57BL/6, імунізаваных 200 мікраграмамі MP4 у поўным ад'юванце Фройнда з дадатковым увядзеннем коклюшнага таксіну ў дзень імунізацыі і паўторна праз 48 гадзін. Ніводная жывёла не атрымлівала метыленавы сіні як прэпарат. Пасля фіксацыі і залівання папярочныя зрэзы спіннога мозгу таўшчынёй адзін мікраметр афарбоўвалі метыленавым сінім для светлавой мікраскапіі, а для больш дэталёвага вывучэння праводзілі электронную мікраскапію вентралатэральнага тракту.

Узоры тканак бралі на трох этапах: на піку вострай стадыі ў 7 мышэй, праз тры месяцы пасля пачатку ў 5 мышэй і праз шэсць месяцаў пасля пачатку ў 10 мышэй. Сярэднія клінічныя балы на гэтых этапах выглядалі амаль аднолькава: каля 1.7–1.8 па шкале ад 0 да 5. Тканкі паказвалі іншую карціну. Колькасць валокнаў з ізаляваным пашкоджаннем міеліну вырасла прыкладна з 569,000 на квадратны міліметр на піку вострай стадыі да прыкладна 1,496,000 праз шэсць месяцаў; розніца паміж вострай і доўгатэрміновай стадыямі была значнай пры P, роўным 0.027. Спалучанае пашкоджанне міеліну і аксонаў прыкладна падвоілася да шостага месяца. Доля валокнаў, у якіх адбывалася рэміелінізацыя, на кожным этапе заставалася ніжэйшай за адзін працэнт — дэталь, якая стрымлівае надзеі на аднаўленне.

Пашкоджанне аксонаў змянялася па U-падобнай крывой: высокае на піку вострай стадыі, ніжэйшае праз тры месяцы і найбольшае праз шэсць месяцаў. Яно карэлявала з набраканнем мітахондрый і памяншэннем адлегласці паміж нейрафіламентамі. Ацэнку праводзілі без ведання балаў і стадыі, што ўмацоўвае выснову: клінічныя балы недастаткова адлюстроўвалі структурнае пашкоджанне, якое працягвалася.

Гэтая неадпаведнасць — сапраўдны ўнёсак даследавання для чытача, які цікавіцца РС. Стабільны бал функцыянальных абмежаванняў не азначаў стабільнага стану тканак. Гэта таксама паказвае, чаму дадзеная праца не можа пацвярджаць ніякіх сцвярджэнняў пра лячэнне РС метыленавым сінім. Яна правярала ўплыў часу, а не лячэння.

Чаму ніводнае даследаванне не даказвае карысці для пацыентаў

Успрымайце кожную працу як добры адказ на вузкае пытанне, але не як адказ на пытанне пра пацыентаў.

Па-першае, адрозніваецца прычына. EAE наўмысна выклікаюць пэўным антыгенам і ад'ювантам. РС у чалавека развіваецца спантанна з удзелам шырэйшага імуннага рэпертуару, які ўключае T-клеткі, B-клеткі, прыроджаны імунітэт і рэзідэнтную глію. Злучэнне, якое змяняе пераважна накіраваны на MOG адказ у мышы, не абавязкова змяняе гэты шырэйшы адказ у чалавека.

Па-другое, адрозніваецца фенатып. Узыходзячая слабасць ад хваста да задніх канечнасцяў у мышы — зручны паказчык. Ён зводзіць разнастайнасць праяў РС у чалавека да аднаго рухальнага бала. Прэпараты часта змяняюць кароткатэрміновыя балы EAE, не змяняючы цячэння захворвання ў чалавека, таму EAE — інструмент скрынінгу і вывучэння механізмаў, а не клініка ў мініяцюры.

Па-трэцяе, пытанні экспазіцыі і часу застаюцца нявырашанымі. Бесперапыннае ўвядзенне з ранняга этапу ў 30-дзённым эксперыменце на мышах — не тое самае, што працяглы прыём унутр чалавекам з ужо развітым захворваннем, і ніводнае даследаванне не вымярала ўзроўняў прэпарату ў нервовай сістэме. Без гэтага звяна няма мосту ад канцэнтрацыі ў лабараторнай пласціне або дозы ў мышы да схемы для чалавека.

Па-чацвёртае, гэтыя дзве працы не паўтараюць адна адну. Розныя антыгены, розныя пытанні, розныя канчатковыя паказчыкі, а ў адным выпадку — поўная адсутнасць лячэння. Спасылацца на іх разам як на два станоўчыя даследаванні лячэння РС — памылка ў катэгарызацыі.

Што гэта азначае для чытачоў, якія ўзважваюць доказы

У гэтых працах няма ўсталяванага пратаколу выкарыстання метыленавага сіняга пры РС. Даследаванне лячэння дае падставы для далейшага вывучэння AMPK, SIRT1, NF-kB і балансу Th17 і Treg пры MOG EAE. Даследаванне паталогіі нагадвае, што пашкоджанне тканак можа прагрэсаваць, нават калі балы застаюцца нязменнымі, а метыленавы сіні ў раздзеле метадаў часам азначае слоік з фарбавальнікам, а не аптэчку. Чытачам, якія сочаць за бягучымі даследаваннямі рассеянага склерозу, варта памятаць пра розніцу паміж фарбавальнікам і прэпаратам. Пытанні бяспекі, уключаючы рызыкі для крыві і рызыкі ўзаемадзеянняў, трэба абмеркаваць з лекарам разам з агульнымі данымі пра бяспеку метыленавага сіняга, перш чым дзейнічаць на падставе загалоўкаў пра лабараторныя вынікі.

Выснова змяшчаецца ў адным сказе. У адным цытаваным даследаванні мышам з MOG EAE уводзілі метыленавы сіні і паведамілі пра менш цяжкае захворванне разам з супрацьзапаленчым зрухам імуннага адказу, а ў другім цытаваным даследаванні нічога не ўводзілі і выкарыстоўвалі метыленавы сіні толькі для афарбоўвання спіннога мозгу, дакументуючы назапашванне пашкоджанняў міеліну і аксонаў на працягу шасці месяцаў, таму гэтыя дзве працы не даказваюць, што метыленавы сіні дапамагае пры РС у чалавека.