Метыленавы сіні і фероптоз: механізм перакіснага акіслення ліпідаў

Фероптоз — гэта гібель клеткі праз пашкоджанне мембраны. Поліненасычаныя тлушчы ў мембранах акісляюцца ў ланцуговай рэакцыі, мембрана страчвае цэласнасць, і клетка гіне. Для гэтай хімічнай рэакцыі неабходнае жалеза. У гэтым сказе заключана ўся канцэпцыя, а ўсё ў гэтым артыкуле — праверка асобных яе частак.

Пытанне тут вузейшае: як метыленавы сіні ўплывае на гэты ланцуг у эксперыментах на клетках і што насамрэч паказвае такі вынік. Кароткі адказ: у двух лабараторных даследаваннях метыленавы сіні ў нанамолярных канцэнтрацыях зніжаў перакіснае акісленне мітахандрыяльных ліпідаў і захоўваў клеткі жывымі пасля ўздзеянняў, якія без яго выклікаюць фероптоз. Разгорнуты адказ важнейшы, бо кожнае звяно ланцуга правяралі асобным умяшаннем, і кожнае ўмяшанне мае свае абмежаванні.

Фероптоз у адным абзацы

Мембранны фасфаліпід з хвастом з поліненасычанай тлустай кіслаты мае слабое месца: атамы вадароду, якія лёгка адняць. Калі радыкал адрывае адзін з іх, да ліпіду далучаецца кісларод, утвараецца ліпідны пераксільны радыкал, які адрывае вадарод ад наступнага ліпіду. Рэакцыя распаўсюджваецца ўздоўж мембраны, пакуль нешта яе не спыніць.

Асноўны механізм спынення — фермент GPX4, які выкарыстоўвае глутатыён для аднаўлення пераксідаў ліпідаў да бясшкодных ліпідных спіртоў. Лабараторныя індуктары атакуюць гэтую абарону ў пэўных кропках. Эрастын блакуе паступленне цыстыну праз сістэму xc-minus, пазбаўляючы клетку цыстэіну для сінтэзу глутатыёну. Бутыянінсульфаксімін непасрэдна блакуе сінтэз глутатыёну. RSL3 інгібіруе сам GPX4. Усе тры пакідаюць пераксіды неабясшкоджанымі, але дзейнічаюць на розных этапах, таму вынік з адным індуктарам нельга аўтаматычна пераносіць на іншыя.

Фероптоз адрозніваецца ад апоптозу сваімі вызначальнымі ўласцівасцямі. Пры ім няма каспазнага каскаду і апаптатычных цельцаў. Хелатары жалеза, такія як дэфераксамін, і рэчывы, якія ўлоўліваюць радыкалы, такія як ферастацін-1, прыгнятаюць яго. Гэта практычны крытэрый, паводле якога даследчыкі называюць гібель фероптатычнай, а не проста некратычнай. Шырэйшая карціна шляхоў рэгуляванай гібелі клетак дапамагае зразумець гэтае адрозненне, а тое, як клеткі абыходзяцца з лабільным жалезам, тлумачыць, чаму хелатаванне — такі вырашальны кантроль.

Якая роля мітахондрый і чаму яна была спрэчнай

У ранніх працах паведамлялася, што клеткі без мітахандрыяльнай ДНК усё роўна зазнаюць фероптоз, што дазваляла меркаваць, што мітахондрыі неабавязковыя. Пазнейшыя працы выявілі, што выдаленне мітахондрый або блакаванне дыхання можа прыгнятаць фероптоз ад недахопу цыстэіну, але не ад непасрэднага інгібіравання GPX4. Абодва вынікі могуць быць правільнымі, калі ўклад мітахондрый залежыць ад індуктара, тыпу клетак і месца, дзе адбываецца вырашальнае перакіснае акісленне.

Даследаванне, на якім грунтуецца гэты артыкул, падышло да спрэчкі з дапамогай зонда, спецыфічнага для асобнага клеткавага кампартмента. MitoCLox — гэта нацэленая на мітахондрыі версія індыкатара перакіснага акіслення ліпідаў: ён змяняе флуарэсцэнцыю пры сустрэчы з ліпіднымі пераксільнымі радыкаламі ўнутры мітахондрый. У фібрабластах, апрацаваных эрастынам, акісленне мітахандрыяльнага зонда з'яўлялася ў яшчэ жывых клетках да іх гібелі і было неаднародным у папуляцыі. Гэтая паслядоўнасць мае значэнне. Перакіснае акісленне, якое папярэднічае гібелі, можа быць яе прычынай. Перакіснае акісленне, вымеранае толькі ў мёртвых клетках, — ужо след разбурэння. Дадатковы матэрыял пра метады вымярэння перакіснага акіслення ліпідаў і тое, што паказвае кожны зонд тлумачыць, чаму месцазнаходжанне зонда вызначае сэнс сігналу.

Такая ж карціна назіралася ў другой мадэлі. Фібрабласты пацыента са спадчыннай аптычнай нейрапатыяй Лебера, якія маюць мутацыю комплексу I і вышэйшы зыходны акісляльны стрэс, гінулі праз фероптоз пры вычарпанні глутатыёну, тады як кантрольныя фібрабласты заставаліся ўстойлівымі. Акісленне мітахандрыяльнага зонда зноў адбывалася першым. Падрабязнасці прыведзены ў даследаванні мітахандрыяльнага перакіснага акіслення ліпідаў пры фероптозе ў фібрабластах.

Што метыленавы сіні змяніў у гэтых эксперыментах

Метыленавы сіні — пераносчык у акісляльна-аднаўленчых рэакцыях. Яго акісленая форма прымае электроны ад рэакцый з удзелам NADH у комплексе I, а адноўленая форма перадае іх цытахрому c, які забяспечвае электронамі комплекс IV. Гэта стварае частковы абыход участку ланцуга, дзе электроны звычайна пераходзяць на кісларод з утварэннем супераксіду. Чытачам, якія хочуць атрымаць поўную карціну гэтай перадачы, варта пачаць з матэрыялу пра тое, як метыленавы сіні пераносіць электроны праз мітахондрыі.

У фібрабластах лёгкіх, апрацаваных эрастынам, метыленавы сіні пры канцэнтрацыі 250 нанамоляр захоўваў жыццяздольнасць паводле тэсту выжывання клетак, як і нацэленыя на мітахондрыі антыаксіданты SkQ1 і MitoTEMPO. Кантрольныя ўмовы вызначаюць межы высновы. Ферастацін-1, альфа-такаферол і дэфераксамін таксама абаранялі клеткі, што пацвярджае фероптатычны характар гібелі. Аналаг SkQ1 без антыаксідантнай групы не абараняў, што паказвае на акісляльна-аднаўленчую хімію, а не на неспецыфічнае назапашванне. Ахоўны эфект слабеў пры канцэнтрацыях SkQ1 вышэй за прыблізна 200 нанамоляр, што адпавядае вядомым прааксідантным уласцівасцям хінонавых антыаксідантаў пры больш высокіх узроўнях. Метыленавы сіні таксама мае такі дваякі канцэнтрацыйна-залежны эфект: у гэтых культурах ён абараняў пры нізкіх нанамолярных канцэнтрацыях, але пры павышэнні канцэнтрацыі або інтэнсіўным асвятленні здольны ўтвараць пераксід вадароду праз акісляльна-аднаўленчае цыклаванне. Такі кантэкст канцэнтрацый разглядаецца ў матэрыяле пра актыўныя формы кіслароду ў мітахондрыях.

Эксперыменты з ізаляванымі мітахондрыямі затым дазволілі раздзяліць крыніцы АФК. У прысутнасці двухвалентнага жалеза субстраты, якія забяспечваюць электронамі комплекс I, разам з ратэнонам стымулявалі акісленне зонда. Ратэнон блакуе перанос электронаў пасля флавінавага ўчастка, таму пераносчыкі перад ім застаюцца адноўленымі, а з флавіну, звернутага да матрыкса, электроны пераходзяць на кісларод. Субстраты, якія забяспечваюць электронамі комплекс III, разам з антыміцынам A давалі шмат пераксіду вадароду, але не выклікалі перакіснага акіслення ліпідаў. Аднолькавы сумарны сігнал АФК, іншае месца ўтварэння, іншы вынік. І SkQ1, і метыленавы сіні прыгняталі перакіснае акісленне, выкліканае комплексам I, не прыгнятаючы само ўтварэнне пераксіду вадароду. Гэта паказвае, што яны дзейнічаюць пасля ўтварэння АФК, на этапе перакіснага акіслення ліпідаў.

Эксперыменты з перагрузкай жалезам і падказка ліпафусцыну

Другое даследаванне падышло да пытання з боку жалеза. У кардыяміяцытах H9c2 пад уздзеяннем цытрату трохвалентнага жалеза і амонію ў субмілімолярных канцэнтрацыях узнікалі мітахандрыяльныя АФК, перакіснае акісленне мітахандрыяльных ліпідаў, затым фероптоз, пасля чаго на працягу 24 гадзін назапашваўся ліпафусцынападобны пігмент. Ліпафусцын — гэта аўтафлуарэсцэнтны, жалезазмяшчальны астатак акісленых ліпідаў і бялкоў, які назапашваецца з узростам. Яго хуткае з'яўленне тут звязвае вострае перакіснае акісленне, выкліканае жалезам, з класічным маркерам старэння. І метыленавы сіні ў нанамолярных канцэнтрацыях, і SkQ1 прадухілялі перакіснае акісленне, гібель і назапашванне пігменту. Ізаляваныя мітахондрыі сэрца пацвердзілі гэтую карціну: ратэнон разам з двухвалентным жалезам выклікаў перакіснае акісленне і пігментападобны сігнал, а абодва рэчывы блакавалі іх. Поўная паслядоўнасць апісана ў даследаванні перагрузкі жалезам у кардыяміяцытах H9c2. Пігментны бок гэтай гісторыі звязаны з тэмай ліпафусцыну і маркераў клеткавага старэння.

Чаго не паказваюць тэсты выжывання клетак

Паказчык жыццяздольнасці, напрыклад CellTiterBlue, паказвае, колькі клетак у культуры застаюцца метабалічна актыўнымі пасля ўздзеяння індуктара разам з патэнцыйным ахоўным рэчывам. Гэта праверка механізму ў вызначанай сістэме. Гэта не вынік лячэння. Ні ў адным з гэтых эксперыментаў рэчыва не ўводзілі пацыенту, не вымяралі клінічны зыход захворвання і не вызначалі тэрапеўтычнае акно ў арганізме.

Чатыры абмежаванні варта назваць выразна. Па-першае, набор тыпаў клетак вузкі: трансфармаваныя фібрабласты лёгкіх, першасныя фібрабласты скуры, уключаючы адну лінію з мітахандрыяльным захворваннем, і лінія кардыяміяцытаў пацука, а таксама ізаляваныя мітахондрыі сэрца пацука. Адчувальнасць адрознівалася паміж лініямі, а лінія LHON была выбрана менавіта праз сваю незвычайную ўразлівасць. Па-другое, індуктары ствараюць крайнія лабараторныя ўмовы: поўную блакаду транспарту або сінтэзу і нагрузкі жалезам, з якімі ніводная тканка не сутыкнулася б за кароткі час. Па-трэцяе, канцэнтрацыю нельга перанесці простым множаннем. Нанамолярная канцэнтрацыя ў культуральным асяроддзі — не доза для чалавека. Паміж культурай і чалавекам стаяць размеркаванне метыленавага сіняга, яго аднаўленне да бясколернай формы ў крыві і тканках, уздзеянне святла і мембранны патэнцыял. Па-чацвёртае, зонды даюць інфармацыю пра ўласны кампартмент. Акісленне MitoCLox паказвае, што ў мітахондрыях утварыліся ліпідныя радыкалы; яно не паказвае, што разрыў плазматычнай мембраны, верагодная канчатковая падзея, быў прадухілены непасрэдна, а не дзякуючы спыненню працэсу на ранейшым этапе.

Такім чынам, абгрунтаваная выснова наступная: у гэтых мадэлях АФК, якія ўтвараюцца ў комплексе I, разам з жалезам выклікаюць перакіснае акісленне мітахандрыяльных ліпідаў, якое папярэднічае фероптозу, а метыленавы сіні ў нізкіх канцэнтрацыях перарывае гэты ўчастак ланцуга. Усё, што выходзіць за межы гэтага ўчастка, патрабуе іншых эксперыментаў на жывёлах, а затым на людзях.