Метыленавы сіні як антыаксідант і прааксідант: што змяняе вынік?

Уявім, што дзве лабараторыі выпрабоўваюць адзін і той жа сіні фарбавальнік і паведамляюць пра супрацьлеглыя вынікі. У першай ізаляваныя мітахондрыі мозгу лепш дыхаюць і выпрацоўваюць больш ATP. У другой той жа прэпарат вылучае значна больш пераксіду вадароду. Абодва паведамленні правільныя. Яны апісваюць адзін і той жа цыкл з двух бакоў, а блытаніна пачынаецца, калі чытачы прымаюць адзін бок за ўсю карціну.

Памылка — пытацца, які ярлык падыходзіць малекуле. Метыленавы сіні перадае электроны, як паказана ў шырэйшым кантэксце на карце яго мішэняў у клетачнай біялогіі. Акіслены фарбавальнік прымае электроны і становіцца бясколерным leucoMB. LeucoMB перадае гэтыя электроны далей і зноў становіцца сінім. Тое, што вы назіраеце, залежыць ад таго, хто аддае электроны, хто іх прымае і ці можа сістэма выдаляць пераксід вадароду, які ўтвараецца па дарозе. Варта пытацца не пра тое, ці з'яўляецца фарбавальнік антыаксідантам, а пра тое, што ўмовы дазваляюць зрабіць гэтаму пераносчыку.

Цыкл, які стварае абодва бакі

У цемры асноўны цыкл кароткі. NADH, NADPH або пераносчыкі ў дыхальным ланцугу аднаўляюць фарбавальнік. Затым у адноўленага фарбавальніка ёсць канкурэнтныя шляхі. Ён можа перадаць электроны цытахрому c і падтрымаць іх паток у абыход пашкоджанага комплексу, таму пры блакаванні комплексу I або III дыханне і мембранны патэнцыял часткова аднаўляюцца. Альбо ён можа перадаць электроны непасрэдна кіслароду, што аднаўляе сінюю форму і ўтварае пераксід вадароду. Паколькі фарбавальнік рэгенеруецца, невялікая яго колькасць можа паўтараць гэты цыкл шмат разоў, бесперапынна расходуючы аднаўленчыя эквіваленты і ўтвараючы пераксід.

Два дадатковыя адгалінаванні цалкам змяняюць хімію. Свабодная медзь або жалеза праз рэакцыі тыпу Фентана ператвараюць гэты пераксід, здольны да дыфузіі, у значна больш разбуральныя лакальныя акісляльнікі. Чырвонае святло адкрывае асобны фотахімічны шлях, пры якім узбуджаны фарбавальнік перадае энергію кіслароду і ўтварае сінглетны кісларод — форму, падрабязна разгледжаную ў тлумачэнні фотахіміі тыпу I і тыпу II. Акісляльна-аднаўленчы цыкл у цемры, пашкоджанне, узмоцненае металамі, і фотадынамічнае пашкоджанне — гэта тры розныя механізмы, якія проста маюць адну зыходную малекулу.

Матрыца ўмоў і вынікаў

Табліца ніжэй — матэрыял, які варта захаваць. Кожны радок паказвае адну зменную, кірунак яе ўплыву і эксперымент, на якім гэта заснавана. Станоўчы вынік азначае ахоўны эфект або паляпшэнне паказчыка. Неспрыяльны — больш акісляльніка, большае вычарпанне запасаў або большае пашкоджанне.

Галоўнае — заканамернасць, якая прасочваецца ва ўсіх радках. Утварэнне пераксіду і біялагічная абарона — асобныя восі. Адно ўздзеянне можа адначасова мець неспрыяльны вынік па першай і станоўчы па другой.

Чаму адна і тая ж доза дае розныя адказы

Канцэнтрацыя вызначае здольнасць пераносіць электроны, а не канчатковы вынік. У даследаванні інтактных мітахондрый мозгу вылучэнне пераксіду з мітахондрый мозгу прыкметна павялічвалася пачынаючы з 50 nM, тады як для відавочнага пашкоджання мітахандрыяльнай ДНК у цемры патрабавалася 100 uM. Гэта прыкладна двухтысячаразовы разрыў паміж першым сігналам і генатаксічнасцю, але не запас бяспекі. Канчатковыя паказчыкі, кампартменты і працягласць уздзеяння адрозніваюцца, таму гэтыя лікі пазначаюць розныя з'явы, а не кропкі на адной крывой. Абмеркаванне залежнасці ад дозы змяшчае такі разрыў паміж слабым сігналам і моцным пашкоджаннем у шырэйшы кантэкст гармезісу.

Субстрат вызначае, дзе ўваходзяць электроны. Крыніцы энергіі, звязаныя з NADH, даюць фарбавальніку шмат аднаўленчых эквівалентаў як для карыснага абыходнага шляху, так і для марнатраўнай рэакцыі з кіслародам. Часта цытаванае абагульненне, што сукцынат робіць фарбавальнік антыаксідантам, а глутамат — прааксідантам, выходзіць за межы дадзеных: у даследаванні сэрца ўмовы вымярэння пераксіду з сукцынатам таксама ўключалі ратэнон, а тканка і доза адрозніваліся ад даследавання мозгу, якое выявіла павышэнне пераксіду пры кожным субстраце і стане дыхання.

Святло змяняе механізм, а не толькі маштаб эфекту. Найбольш выразны кантраст у гэтай сукупнасці — 20 uM у цемры без выяўленага ўплыву на фрагменты мітахандрыяльнай ДНК і 20 uM пры чырвоным святле з пашкоджаннем усіх гэтых фрагментаў. Той, хто параўноўвае эксперымент на святле з эксперыментам у цемры, параўноўвае фотахімію з акісляльна-аднаўленчым цыклам.

Металы пераўтвараюць акісляльнік. Без металаў цыкл фарбавальніка ў цемры ўтварае пераксід — малекулу, здольную да дыфузіі, якую клеткі таксама выкарыстоўваюць як сігнал. Пры наяўнасці даступнай медзі або жалеза фарбавальнік, адноўлены NADH, падтрымлівае аднаўленне металу, а адноўлены метал ператварае пераксід у часціцы гідраксільнага тыпу або пераксідныя формы медзі побач з ДНК. Менавіта так бясклетачныя эксперыменты з NADH і іонамі металаў атрымалі выбарачнае пашкоджанне гарачых кропак і шырокае пашкоджанне ДНК ад аднаго і таго ж зыходнага фарбавальніка. Ці будзе гэты шлях мець значэнне, вызначае абыходжанне з металамі ў кампартменце, а не толькі сам фарбавальнік.

Забяспечанасць крыніцамі энергіі вызначае, ці можа клетка заплаціць. У эндатэліяльных клетках пад уздзеяннем фарбавальніка ў канцэнтрацыі ад 2 да 20 uM выдаленне глюкозы выяўляла акісляльную цану, а забеспячэнне глюкозай яе ліквідавала, хоць глюкоза таксама паскарала аднаўленне фарбавальніка. Хутчэйшы цыкл з забяспечанымі рэсурсамі ахоўнымі сістэмамі лепшы за павольнейшы цыкл з вычарпанымі ахоўнымі запасамі. Лічыце няпоўным любое сцвярджэнне пра акісляльнікі, у якім не ўказаны стан глюкозы або NADPH.

Тканка вызначае набор механізмаў. Эндатэліяльныя клеткі рэгенеруюць NADPH праз метабалізм глюкозы і маюць цытазольныя запасы антыаксідантаў. Ізаляваныя мітахондрыі нічога з гэтага не маюць. Ачышчаная ДНК не мае нават механізмаў рэпарацыі. Вынік у адным прэпараце мала што прадказвае пра іншыя, таму ў запланаваным матэрыяле пра тканкаспецыфічныя адказы трэба будзе разглядаць гэтыя сістэмы асобна.

Прамое вымярэнне — не наступная абарона

У многіх тэкстах зліваюцца два ўзроўні, якія ў эксперыментах застаюцца асобнымі. Адзін узровень пытаецца, колькі акісляльніка з'явілася. Другі — як адказала клетка.

Аналізы пераксіду тыпу Amplex найбліжэйшыя да першага ўзроўню, але нават яны паказваюць чысты паток, гэта значыць утварэнне мінус разбурэнне мінус вывад. Даследаванне мітахондрый мозгу выявіла змены з абодвух бакоў: утваралася больш пераксіду, а даданая разавая порцыя пераксіду выдалялася павольней. Далей па ланцугу стаяць акісленне глутатыёну, расходаванне аскарбатy, акіслены гуанін і пашкоджанні ДНК, якія блакуюць палімеразу. Кожны крок дадае біялагічныя працэсы паміж акісляльнікам і вымераным паказчыкам.

Антыаксідантныя ферменты, рэгуляваныя Nrf2, і мітахандрыяльны біягенез належаць да другога ўзроўню. Гэта адаптыўныя праграмы, якія можа запусціць слабы імпульс пераксіду, і аўтары даследавання абароны мітахондрый мозгу прапануюць менавіта такі трыгер у выглядзе слабога стрэсу, адзначаючы пры гэтым, што прычынны ланцуг праз Nrf2 абапіраецца на папярэднія працы, а не на іх уласную поўную дэманстрацыю. Абарона, якая ўзнікае праз некалькі гадзін дзякуючы новым бялкам, не азначае, што пачатковая хімія была антыаксідантнай. Гэта азначае, што невялікая прааксідантная падзея забяспечыла мацнейшую абарону. Правілы асцярожнага чытання такіх сцвярджэнняў, у тым ліку абмежаванні аналізаў і адрозненні паміж прэпаратамі, разглядаюцца ў кіраўніцтве па чытанні даследаванняў метыленавага сіняга.

Чаму аналізы не ўзгадняюцца паміж сабой

Неспецыфічны зонд, напрыклад дыгідрафлуарэсцэін, паказвае агульнае акісленне зонда, а не канцэнтрацыю пераксіду. Ён залежыць ад хіміі пераксідаз і гему і можа не заўважыць павышэння пераксіду, якое выяўляе адкалібраваны аналіз Amplex. Даследаванне мітахондрый мозгу выявіла рэзкае павышэнне пераксіду без адпаведнага сігналу супераксіду, што засцерагае ад цытавання асобнага сцвярджэння пра антыаксідантны эфект, заснаванага на фарбавальніку. Аптычнае перакрыццё — абгрунтаванае пытанне для кантролю, бо фарбавальнік паглынае бачнае святло паблізу распаўсюджаных палос узбуджэння і выпраменьвання. Аднак у старанна праведзеным даследаванні каліброўку рабілі па вядомай колькасці пераксіду, скарачалі ўздзеянне ўзбуджальнага святла з нязначнай зменай сігналу і пацвердзілі павольнейшае выдаленне пераксіду асобным электродам. Інтэрферэнцыю трэба правяраць кантрольным доследам, а не аўтаматычна адхіляць вынік праз яе магчымасць.

Вынік з кальцыем паказвае тую ж патрэбу ў дакладнасці. Вострае ўздзеянне фарбавальніка не змяняла агульную кальцыевую нагрузку да пераходу пранікальнасці ў даследаванні сэрца, аднак ён паляпшаў хуткасць паглынання кальцыю ў мітахондрыях мозгу з блакаваннем дыхальнага ланцуга ў арыентаваным на дыябет даследаванні мітахондрый сэрца. Розныя канчатковыя паказчыкі, розныя сістэмы — ніякай супярэчнасці.

Што праверыць, перш чым давяраць выснове

Успрымайце кожную выснову пра антыаксідантны або прааксідантны эфект як паведамленне пра канкрэтную сістэму і задавайце пяць пытанняў. Пры якой канцэнтрацыі і ў якім кампартменце? З якім донарам электронаў і якім канкурэнтным акцэптарам? На святле ці ў цемры, пры якой даўжыні хвалі і дозе? Якія металы даступныя і наколькі забяспечаны запасы крыніц энергіі і антыаксідантаў? І якім аналізам гэта вымяралася: паток акісляльніка, пашкоджанне ці адаптыўны адказ? Змяніце любы адзін адказ — і тая ж малекула можа перамясціцца ў матрыцы ад ахоўнага да пашкоджвальнага эфекту без усякага парадоксу.