Ці можа метыленавы сіні абыходзіць мітахандрыяльны комплекс III? Чаму даследаванні разыходзяцца

Дзве лабараторыі даследавалі, ці можа метыленавы сіні абыходзіць заблакаваны мітахандрыяльны комплекс III. Адна адказала: не. Другая: так. Абедзве мелі даныя.

Першае даследаванне, праведзенае на мітахондрыях мозгу мышэй, паказала, што фарбавальнік не можа гэтага рабіць. Другое, на мітахондрыях мозгу трох відаў грызуноў, паказала, што часткова можа. Трэцяе даследаванне, на печані мышэй, часта згадваюць побач, але яно правярала нешта іншае. Калі разглядаць яго ў належным кантэксце, палова блытаніны знікае.

Універсальнага механізму, які можна было б абвясціць, няма. Ёсць тры эксперыменты з рознымі блакатарамі, дозамі і паказчыкамі. Спачатку прачытайце ўмовы. Высновы вынікаюць з іх.

Што тут азначае абыход

Электроны ўваходзяць у ланцуг праз комплекс I (ад NADH) або комплекс II (ад сукцынату), праходзяць праз комплекс III да цытахрому c, а затым праз комплекс IV да кіслароду. Градыент, створаны на гэтым шляху, клетка выкарыстоўвае для сінтэзу ATP.

Сцвярджэнне пра абыход азначае, што метыленавы сіні прымае электроны да месца блакавання і перадае іх пасля яго. Акіслены фарбавальнік прымае электроны ад NADH або пачатковых кампанентаў ланцуга, ператвараючыся ў лейкаметыленавы сіні, а адноўленая форма перадае іх цытахрому c або назад у ланцуг. Калі перадача адбываецца пасля месца блакавання, дыханне і мембранны патэнцыял часткова аднаўляюцца. Калі ў месцы блакавання або да яго, нічога не аднаўляецца.

Адна асаблівасць комплексу III шмат у чым вызначае гэтую спрэчку. Комплекс працуе праз Q-цыкл і мае два ўчасткі звязвання інгібітараў. Антыміцын звязваецца з участкам Qi. Міксатыязол звязваецца з участкам Qo. Даследаванне, якое выкарыстоўвае толькі адзін з іх, правярае толькі палову комплексу.

Даследаванне першае: няма абыходу ў мітахондрыях мозгу мышэй

Gureev і калегі выкарыстоўвалі мітахондрыі кары мозгу мышэй C57BL/6, выдзеленыя з дапамогай дзігітаніну; вымярэнні праводзілі пры 0.1 mg бялку на ml. Субстраты ахоплівалі тры рэжымы: піруват і малат, кожны ў канцэнтрацыі 5 mM, сукцынат у канцэнтрацыі 10 mM з глутаматам у канцэнтрацыі 2 mM і L-пралін у канцэнтрацыі 10 mM. Блакатарамі былі ратэнон у канцэнтрацыі 1 мікрамоляр (комплекс I) і антыміцын у канцэнтрацыі 1 мікраграм на ml (комплекс III). Дозы фарбавальніка складалі 0.5, 1 і 2 мікрамоляр, прычым асноўнай канцэнтрацыяй быў 1 мікрамоляр. Методыкі і запісы вымярэнняў прыведзены ў паведамленні FEBS Letters.

Абыход комплексу I працаваў. Ратэнон зніжаў дыханне, стымуляванае ADP, прыкладна са 121 да 2 nmol за хвіліну на mg, а фарбавальнік у канцэнтрацыі 1 мікрамоляр аднаўляў яго прыкладна да 21. Мембранны патэнцыял аднаўляўся на піруваце з малатам і на L-праліне.

Абыход комплексу III не працаваў. Антыміцын зніжаў дыханне прыкладна да 16, а фарбавальнік павышаў яго толькі прыкладна да 20. Мембранны патэнцыял не аднаўляўся ні на адным субстраце пры дозах фарбавальніка да 5 мікрамоляр. Даныя пра перакіс паказвалі на тое ж: сам фарбавальнік павышаў выдзяленне перакісу з базавай хуткасці каля 76 pmol за хвіліну на mg прыкладна да 1170, 1460 і 1945 пры трох дозах, аднак антыміцын зніжаў гэты выкліканы фарбавальнікам сігнал прыкладна на 25, 88 і 96 працэнтаў адпаведна. Калі б адноўлены фарбавальнік рэагаваў непасрэдна з кіслародам, блакаванне комплексу III не павінна было б прыгнятаць сігнал. Аўтары зрабілі выснову, што адноўлены фарбавальнік акісляецца на ўчастку Qo комплексу III, да месца блакавання антыміцынам. Кароткі цыкл, словамі: ад донараў да фарбавальніка, ад фарбавальніка да Qo, далей звычайным шляхам. Ратэнон абыходзіцца. Антыміцын — не.

Даследаванне другое: частковы абыход у трох відаў, на абодвух участках звязвання інгібітараў

Svab і калегі пашырылі схему эксперыменту. Мітахондрыі мозгу мышэй, пацукоў і марскіх свінак выдзялялі з дапамогай Percoll і даследавалі пры тых жа 0.1 mg на ml, на піруваце з малатам або глутамаце з малатам, кожны ў канцэнтрацыі 5 mM. Яны выкарыстоўвалі два блакатары комплексу III: антыміцын A у канцэнтрацыі 0.3 мікрамоляр і міксатыязол у канцэнтрацыі 1 мікрамоляр. Канцэнтрацыя фарбавальніка складала 2 мікрамоляр у большасці вымярэнняў і 0.5 у доследах з цытахромам c. Даныя па ўсіх трох відах, атрыманыя паводле ўзгодненых пратаколаў, прыведзены ў артыкуле з адкрытым доступам.

Абодва блакаванні часткова абыходзіліся ва ўсіх трох відаў. У мітахондрыях мышэй антыміцын прыгнятаў дыханне, а фарбавальнік павышаў яго прыкладна на 60 працэнтаў, прыблізна з 37 да 59 nmol за хвіліну на mg. Міксатыязол прыгнятаў яго на 88 працэнтаў, прыкладна да 4.5, а фарбавальнік павышаў яго ў пяць разоў, прыкладна да 23. Пры любым з інгібітараў мембранны патэнцыял часткова аднаўляўся; яго вымяралі двума фарбавальнікамі (сафранінам O і ратыяметрычным TMRM), каб выключыць аптычныя артэфакты.

У гэтай працы таксама непасрэдна праверылі перадачу электронаў, чаго ў першым даследаванні не рабілі. Экзагенны ацэтыляваны цытахром c у канцэнтрацыі 25 мікрамоляр не аднаўляўся мітахондрыямі ў энергізываным стане ні з інгібітарамі, ні без іх, але даданне фарбавальніка выклікала аднаўленне ў абодвух выпадках. У буферы без клетак NADH разам з фарбавальнікам аднаўляў цытахром c з хуткасцю, прапарцыянальнай NADH. Больш доўгі пераход, словамі: аднаўленчыя эквіваленты да фарбавальніка, фарбавальнік непасрэдна да цытахрому c, комплекс IV да кіслароду. Гэты шлях цалкам мінае комплекс III, таму абодва блакатары можна абысці.

Два дадатковыя паказчыкі падтрымліваюць такую інтэрпрэтацыю. Флуарэсцэнцыя NAD(P)H зніжалася пры даданні фарбавальніка да мітахондрый, апрацаваных міксатыязолам, што азначае адток аднаўленчых эквівалентаў па новым шляху. Акрамя таго, аптычнае паглынанне фарбавальніка пры 660 nm адсочвала кожнае паслядоўнае даданне, а аналіз супернатантаў пасля цэнтрыфугавання паказаў, што акіслены фарбавальнік назапашваецца ўнутры мітахондрый у энергізываным стане ў больш чым сто разоў і выходзіць пры падзенні патэнцыялу. Пратонны баланс таксама адпавядае гэтай карціне: абыход этапаў перапампоўвання пакідае прыкладна 2 пратоны на пару электронаў замест 10, таму больш хуткае спажыванне кіслароду пры толькі частковым аднаўленні палярызацыі — гэта праява сапраўднага абыходу, а не доказ супраць яго.

Тая ж прэпарацыя давала рэакцыі, якія лёгка няправільна зразумець пры павярхоўным чытанні. Пры наяўнасці інгібітару і фарбавальніка ADP зніжаў дыханне замест яго павышэння, а блакаванне транспарту стымулявала яго замест запаволення, пры гэтым мембранны патэнцыял усё яшчэ змяняўся ў звычайных напрамках. Само па сабе спажыванне кіслароду ў гэтай сістэме ўводзіць у зман.

Даследаванне трэцяе: праца на печані, якая правярала комплексы I і II, а не III

Lee і Boelsterli выкарыстоўвалі мітахондрыі печані мышэй і культываваныя гепатацыты, пашкоджаныя эфавірэнзам (комплекс I, IC50 каля 30 мікрамоляр) і гідразінам, метабалітам ізаніязіду (комплекс II, IC50 каля 30 мікрамоляр). Фарбавальнік у канцэнтрацыі каля 30 мікрамоляр аднаўляў акісленне NADH, мембранны патэнцыял і ATP, адначасова зніжаючы ўзровень акісляльнікаў і некратычную гібель. У артыкуле Redox Biology гэта мадэлюецца як перанос электронаў фарбавальнікам у абыход пашкоджаных комплексаў I і II.

Гэты вынік — пацверджаны кантэкст для папярэдніх участкаў ланцуга, і ён нічога не кажа пра комплекс III, бо ў ім нічога не блакавалі. Ён не можа ні пацвердзіць, ні абвергнуць ніводнае з даследаванняў мозгу.

Матрыца ўмоў

Чатыры прычыны, чаму абодва даследаванні комплексу III могуць мець рацыю для сваіх умоў

1. Блакатары не былі аднолькавым умяшаннем. Толькі антыміцын у канцэнтрацыі 1 мікраграм на ml супраць антыміцыну ў канцэнтрацыі 0.3 мікрамоляр і асобнага блакатару ўчастка Qo. Шлях фарбавальніка, які падае электроны на ўчастак Qo, не спрацоўвае менавіта там, дзе шлях непасрэдна да цытахрому c спрацоўвае. Адзін участак не можа прадстаўляць абодва.

2. Доза фарбавальніка і час адрозніваліся. Асноўныя канцэнтрацыі 1 супраць 2 мікрамоляр для рэчыва, якое ўдзельнічае ў акісляльна-аднаўленчым цыкле і чые паглынанне і непасрэднае аднаўленне цытахрому c залежаць ад канцэнтрацыі і часу. Невялікія адрозненні ў дозе разам з розным часам вымярэнняў могуць выяўляць розныя галіны адной сеткі.

3. Прэпарацыі адрозніваліся. Выдзяленне з дапамогай дзігітаніну і выдзяленне ў градыенце Percoll адбіраюць папуляцыі мітахондрый, якія перакрываюцца, але не з'яўляюцца ідэнтычнымі. Канцэнтрацыя бялку была аднолькавай — 0.1 mg на ml, таму гэтая зменная выключаецца, але адрозненні ў субпапуляцыях і цэласнасці застаюцца. А падазрэнне наконт відавых адрозненняў было знятае: другая група ўзнавіла свой фенатып і ў мышэй.

4. Субстратныя ўмовы вызначаюць, што можа рабіць фарбавальнік. Тры субстратныя рэжымы супраць пар, звязаных з NADH. Забеспячэнне NADH і мембранны патэнцыял сумесна вызначаюць, наколькі хутка аднаўляецца фарбавальнік і як ён размяркоўваецца, а шлях, якому патрэбны адноўлены фарбавальнік побач з акісленым цытахромам c, залежыць ад гэтага выбару.

Як чытаць наступнае сцвярджэнне пра абыход

Спытайце, які комплекс быў заблакаваны, якім інгібітарам, на якім участку і пры якой дозе. Спытайце пра канцэнтрацыю фарбавальніка і час вымярэння. Спытайце пра тканку, від, спосаб выдзялення, канцэнтрацыю бялку і субстрат. І спытайце, ці ўзгадняюцца патэнцыял, дыханне, акісляльна-аднаўленчы стан і непасрэднае вымярэнне перадачы электронаў, бо само па сабе спажыванне кіслароду тут не раз паказвала памылковы напрамак.

Сціслае падсумаванне застаецца ў сіле. Абыход комплексу I фарбавальнікам не выклікае рознагалоссяў. Што да комплексу III, мітахондрыі мышэй з антыміцынам у канцэнтрацыі 1 мікраграм на ml і фарбавальнікам у канцэнтрацыі 1 мікрамоляр не паказваюць функцыянальнага абыходу, тады як тры віды з антыміцынам у канцэнтрацыі 0.3 мікрамоляр або міксатыязолам у канцэнтрацыі 1 мікрамоляр і фарбавальнікам у канцэнтрацыі 2 мікрамоляр паказваюць частковы абыход з непасрэднай перадачай электронаў ад фарбавальніка да цытахрому c. Гэтыя сцвярджэнні сумяшчальныя. Усё шырэйшае — экстрапаляцыя.

Звязаныя матэрыялы змяшчаюць спрэчнае сцвярджэнне ў кантэкст бясспрэчнай хіміі: як метыленавы сіні пераносіць электроны — пра эстафету пераносу, эксперыменты з абыходам комплексу I — пра пацверджаны выпадак на папярэднім участку ланцуга, вымярэнні мембраннага патэнцыялу і іх артэфакты — пра тое, чаму спатрэбіліся два фарбавальнікі, і лабараторная праца з рэчывамі, якія ўдзельнічаюць у акісляльна-аднаўленчых цыклах, — пра пасткі дазавання і выбару часу.