Альтэрнатывы метыленаваму сіняму для мікраскапіі

Для простага бактэрыяльнага мазка крышталічны фіялетавы можа замяніць метыленавы сіні, калі мэта — убачыць форму клетак. Для жывых клетак лепшай альтэрнатывай можа быць фазавы кантраст без усялякага афарбоўвання. Выбар залежыць ад назірання, якое вам трэба правесці.

Уявім, што два чалавекі даследуюць адну і тую ж бактэрыяльную культуру. Адзін хоча адрозніць палачкападобныя клеткі ад круглых. Другі хоча высветліць, ці загінулі бактэрыі ў выніку апрацоўкі. Фарбавальнік, які дае першаму выразную выяву, можа не даць другому ніякага прыдатнага адказу.

Перш чым выбіраць замену, дапоўніце гэты сказ: «Мне трэба назіраць ___ у ___, і клеткі павінны / не павінны заставацца жывымі». Гэты сказ вызначае задачу, якую павінен выконваць фарбавальнік.

Пачніце з узору і пытання

Спачатку вызначце, ці павінны клеткі заставацца жывымі, а затым — якую прыкмету трэба назіраць:

Клеткі павінны заставацца жывымі: для назірання за рухам або формай разгледзьце фазавы кантраст без афарбоўвання або DIC; для ядзернай ДНК — Hoechst 33342 з флуарэсцэнтнай візуалізацыяй; для цэласнасці мембраны выбірайце валідзіраваны аналіз, напрыклад SYTO 9 з ёдыдам пропідыю.
Клеткам не абавязкова заставацца жывымі: для бактэрыяльнай марфалогіі разгледзьце простае афарбоўванне крышталічным фіялетавым або негатыўнае афарбоўванне нігразінам; для рэакцыі па Граму выкарыстоўвайце поўны метад афарбоўвання па Граму; для ядзернай ДНК у фіксаваных клетках разгледзьце флуарэсцэнтнае афарбоўванне DAPI.

Выкарыстоўвайце гэтую табліцу, каб параўнаць абмежаванні кожнага варыянту. Гэта выбар метадаў, а не інструкцыя па замене флаконаў у межах існуючага пратакола.

Што трэба назіраць	Узор і абсталяванне	Магчымая альтэрнатыва	Асноўнае абмежаванне
Форма і размяшчэнне бактэрый	Падрыхтаваны бактэрыяльны мазок; светлае поле	Простае афарбоўванне крышталічным фіялетавым	Паказвае марфалогію; не вызначае рэакцыю па Граму або жыццяздольнасць.
Контуры клетак на цёмным фоне	Бактэрыялагічны прэпарат; светлае поле	Негатыўнае афарбоўванне нігразінам	Падрыхтоўка і склад рэагента маюць значэнне; неафарбаваная клетка не абавязкова жывая.
Рэакцыя па Граму	Падрыхтаваны бактэрыяльны мазок; светлае поле	Поўны метад афарбоўвання па Граму	Патрабуе поўнай паслядоўнасці рэагентаў і кантроляў.
Рух або змены ў жывых клетках	Сумяшчальны вільготны прэпарат; фазавы кантраст або DIC	Без фарбавальніка	Патрабуе адпаведнай оптыкі; кантраст не ідэнтыфікуе малекулу.
Ядзерная ДНК	Фіксаваныя клеткі; флуарэсцэнцыя	DAPI	Патрабуе сумяшчальных фільтраў узбуджэння і выпраменьвання.
Ядзерная ДНК у жывых клетках	Жывыя клеткі; флуарэсцэнцыя	Hoechst 33342	Пранікненне ў клетку не азначае, што ўмовы візуалізацыі бясшкодныя.
Цэласнасць бактэрыяльнай мембраны	Нефіксаваныя бактэрыі; флуарэсцэнцыя	SYTO 9 з ёдыдам пропідыю	Афарбоўванне мембраны з'яўляецца ўскосным паказчыкам жыццяздольнасці.

Для простага мазка асцярожна замяняйце метад

Крышталічны фіялетавы — практычны варыянт, калі задача заключаецца ў атрыманні аднакаляровай выявы бактэрыяльнай марфалогіі. У Bacteriological Analytical Manual FDA прыведзены дзве рэцэптуры крышталічнага фіялетавага, прыдатныя для простага афарбоўвання. Выкарыстоўвайце задакументаваную рэцэптуру і адпаведны метад яе падрыхтоўкі; адна толькі назва фарбавальніка не вызначае рабочы рэагент.

Крышталічны фіялетавы таксама выкарыстоўваецца пры афарбоўванні па Граму, але гэта не робіць простае афарбоўванне крышталічным фіялетавым афарбоўваннем па Граму. У пратаколе афарбоўвання па Граму ASM дыферэнцыяльны вынік залежыць ад паслядоўнага дзеяння крышталічнага фіялетавага, ёду, абясколервання і дафарбоўвання. Пропуск гэтых этапаў змяняе тое, што можна вызначыць па выяве. Падрабязней пра гэта адрозненне гл. у матэрыяле простае афарбоўванне ў параўнанні з афарбоўваннем па Граму.

Нігразін дазваляе выявіць контуры іншым спосабам: ён зацямняе фон, а бактэрыяльныя клеткі застаюцца параўнальна светлымі. У інструкцыі Merck па нігразіне ёсць важная дэталь, якую лёгка прапусціць у агульным спісе заменнікаў. У склад указанай рабочай рэцэптуры ўваходзіць фармальдэгід. Таму па словах «негатыўнае афарбоўванне» нельга рабіць выснову аб сумяшчальнасці з жывымі клеткамі, нават калі самі клеткі выглядаюць неафарбаванымі. Правярайце поўны склад і спосаб падрыхтоўкі ўзору.

Для жывых узораў разгледзьце магчымасць змяніць оптыку

Калі вы хочаце назіраць за рухам або дзяленнем клетак, увядзенне яшчэ аднаго фарбавальніка можа ўскладніць назіранне. Як тлумачыць Nikon у кіраўніцтве па кантрасце празрыстых узораў, фазавы кантраст і дыферэнцыяльна-інтэрферэнцыйны кантраст, або DIC, робяць узоры бачнымі дзякуючы адрозненням у іх аптычных уласцівасцях. Яны дазваляюць назіраць жывыя неафарбаваныя клеткі пры ўмове, што мікраскоп мае неабходныя кампаненты.

Такі выбар захоўвае прэпарат неафарбаваным, але змяняе даступную інфармацыю. Можна назіраць за мяжой клеткі або яе рухам, не ведаючы, якая менавіта малекула стварыла кантраст. Калі пытанне датычыцца лакалізацыі малекул, выберыце адпаведны метад маркіроўкі.

Для ядзернай ДНК у параўнанні фарбавальнікаў DAPI і Hoechst ад Invitrogen адрозніваецца звычайнае выкарыстанне DAPI з фіксаванымі клеткамі ад больш клеткапранікальнага Hoechst 33342, якому аддаюць перавагу для маркіроўкі жывых клетак. Абодва патрабуюць флуарэсцэнтнага абсталявання. Ні адзін з іх не з'яўляецца прамой заменай каляровага фарбавальніка для светлапольнай мікраскапіі.

Разглядайце ўздзеянне фарбавальніка і асвятленне як эксперыментальныя ўмовы. Калі паводзіны клетак з'яўляюцца вашым вымяраемым параметрам, параўноўвайце афарбаваныя і неафарбаваныя прэпараты.

Чырвоная клетка не абавязкова мёртвая

SYTO 9 і ёдыд пропідыю часта выкарыстоўваюць разам для ацэнкі цэласнасці бактэрыяльнай мембраны. У кіраўніцтве BacLight цэлыя мембраны звязваюцца з зялёным афарбоўваннем, а пашкоджаныя — з чырвоным. Такая інтэрпрэтацыя патрабуе валідацыі для канкрэтнага ўзору.

Даследаванне Rosenberg і суаўтараў 2019 года паказвае гэтую праблему. У 24-гадзінных біяплёнках E. coli на шкле ў фосфатна-буферным солевым растворы каля 96% клетак выглядалі станоўчымі па ёдыдзе пропідыю in situ. Аднак аўтары ацанілі, што пасля збору 82% клетак былі здольныя да культывавання. Канфакальныя выявы паказалі клеткі з зялёнай унутранай часткай пад матэрыялам, афарбаваным у чырвоны, што паказвала на пазаклеткавыя нуклеінавыя кіслоты як крыніцу памылковага сігналу.

Гэтыя працэнты апісваюць розныя вымярэнні на прэпаратах з дадзенага даследавання, а не ўніверсальны паправачны каэфіцыент. Практычная выснова — трэба правяраць, што менавіта стварыла сігнал. У біяплёнцы фарбавальнік нуклеінавых кіслот можа выяўляць матэрыял як па-за клеткамі, так і ўнутры пашкоджаных клетак. Для высновы аб жыццяздольнасці даследчыкі рэкамендуюць дадатковыя вымярэнні, напрыклад культываванне або ацэнку метабалічнай актыўнасці, адзначаючы, што кожны метад мае свае абмежаванні.

Праверце, што насамрэч утрымлівае альтэрнатыва

Альтэрнатыўны метад афарбоўвання ўсё роўна можа ўтрымліваць метыленавы сіні. Прыклад — Giemsa: Merck апісвае свой прадукт як раствор азур-эазін-метыленавы сіні, прызначаны, сярод іншага, для мазкоў крыві і касцявога мозгу. Гэта можа быць іншы метад для іншага ўзору, але ён не адпавядае патрабаванню выключыць метыленавы сіні.

Калі выключэнне пэўнага злучэння з'яўляецца часткай эксперымента, перад параўнаннем выяў праверце ідэнтычнасць рэагента і яго склад. У кіраўніцтве пра methyl blue, метыленавы сіні і фарбавальнікі з падобнымі назвамі разглядаюцца адрозненні ў назвах.

Праверце замену перад выкарыстаннем выніку

Для новага метаду правядзіце невялікае параўнанне з выкарыстаннем рэпрэзентатыўных узораў і адпаведнага кантролю. Па магчымасці захоўвайце супастаўныя налады мікраскопа. Запісвайце склад рэагента, падрыхтоўку ўзору, уздзеянне і ўмовы візуалізацыі, каб больш якасную на выгляд выяву можна было даследаваць, а не проста палічыць лепшай.

Ацэньвайце поспех адносна зыходнага пытання. Для марфалогіі правярайце, ці застаюцца межы клетак і іх размяшчэнне прыдатнымі для інтэрпрэтацыі. Для маркіроўкі ядра ацэньвайце лакалізацыю сігналу і фон. Для ацэнкі жыццяздольнасці патрабуйце доказаў, акрамя прывабнага каляровага падзелу. Больш шырокае кіраўніцтва па афарбоўванні метыленавым сінім і лабараторных прымяненнях тлумачыць, як назіранне і падрыхтоўка прэпарата звязаны паміж сабой.

Выбірайце альтэрнатыву, якая захоўвае патрэбнае вам вымярэнне. Колер — толькі адна з уласцівасцей атрыманай выявы.