Metilen mavisi hüceyrələrə necə daxil olur: reduksiya, təkrar oksidləşmə və membranda paylanma

Bir qabdakı endotel hüceyrələrinin metilen mavisini mənimsəməsinə baxanda ağla ilk gələn izah elə yanlış izahdır. Mühit mavi rəngini itirir, hüceyrələrdə isə mavi qranullar yaranır; deməli, boyaq membrandan mavi molekul şəklində keçmiş olmalıdır. Təcrübələr isə əksini göstərir. Mavi forma membrandan demək olar ki, keçmir. Keçən rəngsiz formadır; hüceyrənin daxilində gördüyünüz mavi rəng isə daxilolmadan sonra elə orada yaranır.

Bu tərsinə mexanizm vacibdir, çünki boyanmanın nəyi göstərə biləcəyini və nəyi göstərə bilməyəcəyini müəyyən edir. Mavi qranullar orqanoidlərdə təkrar oksidləşmiş və tutulub qalmış oksidləşmiş boyağı göstərir. Onlar hüceyrədəki boyağın ümumi miqdarını göstərmir, reduksiya olunmuş forma ehtiyatını göstərmir və bioloji təsiri ölçmür. Səbəbini anlamaq üçün üç mərhələni izləyin: səthdə reduksiya, reduksiya olunmuş formanın diffuziyası, hüceyrə daxilində təkrar oksidləşmə və tutulma.

İki forma fərqli molekullar kimi davranır

Oksidləşmiş metilen mavisi yastı, müsbət yüklü halqa sistemidir. Suda həll olur, təxminən 600 ilə 700 nanometr arasında işığı güclü udur və mavi görünür. Əsas məsələ yükdür. Yüklü, suya meyilli molekul lipid membranından asanlıqla keçmir; buna görə ədəbiyyatda ehtiyatla işlədilən ifadə membranı heç keçməyən deyil, membranı nisbətən çətin keçəndir.

Leykometilen mavisi adlanan reduksiya olunmuş metilen mavisi rəngsiz, yüksüz və yağda həllolandır. Yük aradan qalxdıqda membran artıq divar rolunu oynamır. Reduksiya olunmuş molekul membrandan asanlıqla diffuziya edir və daha oksidləşdirici bir bölməyə daxil olduqdan sonra yenidən elektronlarını itirərək mavi, yüklü və tutulub qalan formaya qayıda bilər. Buna görə boyağın redoks kimyası həm də onun daşınma mexanizmidir. Elektronların sayı dəyişdikdə membran keçiriciliyi də dəyişir.

İlk mərhələ üçün elektronları hüceyrənin özü təmin edir. Məməli hüceyrələri plazma membranı boyunca elektron daşınmasını həyata keçirərək reduksiyaedici ekvivalentləri hüceyrədaxili donorlardan səthdəki akseptorlara ötürür. Plazma membranı boyunca baş verən bu fəaliyyət əksər hüceyrə tiplərində rast gəlinən normal hüceyrə funksiyasıdır. Tiazin boyaqlarını reduksiya edən endotel səth reduktazası bir əlamətdar cəhətdən digər oxşar sistemlər kimi davranır: sonrakı mərhələləri dayandıran dozalarda sianid və azid mövcud olduqda belə fəaliyyətini davam etdirir. Bütün izahın əsasını bu ayrılıq təşkil edir.

Əvvəlcə fazalararası paylanma modeli yarandı və mənimsənilməni demək olar ki, izah etdi

1929-cu ildə Rokfeller İnstitutunda Marian Irwin daha sadə bir sual verdi. Bəlkə boyağın daxilolması sadəcə su ilə hüceyrənin yağlı təbəqələri arasında paylanmadır və laboratoriyada xloroform təbəqəsi həmin yağlı təbəqələri əvəz edə bilər. Onun spektrofotometrik nüfuzetmə tədqiqatlarında boyağın sulu məhlulları xloroformla çalxalanmış, üzvi fazaya keçən maddələrlə canlı yosun hüceyrələrinə daxil olanlar müqayisə edilmişdi.

Həmin işin iki nəticəsi hələ də diqqətə layiqdir. Birincisi, kommersiya metilen mavisi məhlullarında indi azure B adlanan trimetil tionin var idi və bu qatışıq metilen mavisinin özündən daha sürətlə nüfuz edirdi; bu, xüsusilə lipiddə həllolan sərbəst əsas formasının üstünlük təşkil etdiyi qələvi pH şəraitində müşahidə olunurdu. Metilen mavisinin daxilolması kimi görünən bəzi hallar əslində azure B-nin seçici daxilolması idi. İkincisi, pH ionlaşma vəziyyətini müəyyən etməklə nəticəni təyin edirdi, zədələnmiş hüceyrələr isə bütöv hüceyrələrdən xeyli çox boyaq qəbul edirdi. Paylanma əmsalları və yük vəziyyəti həm süni sistemin, həm də canlı hüceyrənin nəyi mənimsədiyini müəyyən edirdi. İkisi arasındakı oxşarlıq hüceyrə sərhədində qeyri-sulu təbəqələrin olması fikrini dəstəkləyirdi.

Model lipidlər və ionlaşma baxımından qabaqcıl idi, lakin öz formasında fazalar arasında paylanan boyaqla səthdə kimyəvi çevrilməyə məruz qalan, başqa formada sərhədi keçən və hüceyrə daxilində əvvəlki formasına qayıdan boyağı bir-birindən ayıra bilmirdi. Bu fərqi müəyyənləşdirmək üçün başqa bir təcrübə lazım idi və həmin təcrübə yetmiş il sonra ağciyər endotelində aparıldı.

Xaricdə reduksiya, daxildə tutulma

Merker və həmkarları kulturada yetişdirilmiş iribuynuzlu heyvanların ağciyər arteriyası endotel hüceyrələri ilə işləyərək üçmərhələli ardıcıllıq təklif etdilər: oksidləşmiş boyaq hüceyrə səthində rəngsiz lipofil formasına reduksiya olunur, reduksiya olunmuş forma içəri diffuziya edir, hüceyrədaxili təkrar oksidləşmə isə membranı keçməyən oksidləşmiş formanı yenidən yaradır və bu forma toplanır. Daha sonra onların endoteldə tiazin mənimsənilməsinə dair tədqiqatı bu ardıcıllığı müəyyən nöqtələrdə pozmağa çalışaraq yoxladı.

İlk vasitə hüceyrəyə daxil ola bilməyən elektron akseptoru — ferrisianid idi. Səth fermentləri hüceyrədən kənarda mavi boyağı rəngsiz formasına reduksiya etdikdə ferrisianid həmin elektronları geri alaraq boyaq membrandan keçməzdən əvvəl mühitdə mavi formanı yenidən yarada bilər. Ferrisianid artıq miqdarda olduqca (10 mikromolyar boyağa qarşı 50 ilə 500 mikromolyar ferrisianid) boyağın mənimsənilməsi demək olar ki, dayanırdı; yalnız ferrisianid tükəndikdən sonra mənimsənilmə normal sürətlə bərpa olunurdu. Kinetika eyni mexanizmi başqa yolla da göstərirdi. Ferrisianid təxminən sabit sürətlə yox olurdu; bu, təkrar dövr edə bilən mediatoru təmin edən sabit səth reduksiyası axınına uyğun gəlirdi. Hüceyrədənkənar boyaq isə ehtiyatı tükəndikcə eksponensial şəkildə azalırdı. Sabit axınla tükənən ehtiyatın birlikdə müşahidə olunması o deməkdir ki, ferrisianid siqnalı məhluldan çıxan boyaq molekullarını deyil, davamlı reduksiyanı göstərir.

İkinci vasitə membrandan keçid mərhələsini tamamilə aradan qaldırdı. Qrup yaxın tiazin analoqu olan toluidin mavisi O-nu hər iki oksidləşmə vəziyyətində hüceyrəyə daxil ola bilməyəcək qədər böyük poliakrilamid zəncirinə bağladı. Hüceyrələr yenə də zəncirə bağlanmış boyağı reduksiya edirdi. Deməli, reduksiya üçün hüceyrənin daxilinə giriş lazım deyil. Bu prosesi həyata keçirən mexanizm səthdə yerləşir və ya onunla elektrik əlaqəsindədir.

Sonra məqalənin adını müəyyən edən ayrılıq üzə çıxdı. 2 millimolyar konsentrasiyada sianid və azid boyağın toplanmasını güclü şəkildə azaldırdı; mikroskop altında normalda nüvəni əhatə edən tünd mavi və bənövşəyi daxilolmalar demək olar ki, yox olurdu. Lakin inhibitorların heç biri hüceyrədənkənar reduksiyanı ləngitmirdi: ferrisianid dövranı azalmadan davam edir, membrandan keçməyən polimerə bağlı boyaq isə yenə reduksiya olunurdu. Bloklanma sonrakı mərhələdə baş verirdi. Sianid və azid səth reduksiyasını deyil, hüceyrədaxili təkrar oksidləşməni və təcrid olunaraq saxlanmanı dayandırırdı. Hüceyrə həyat qabiliyyətinin yoxlanılması da bu izahı dəstəkləyirdi: həmin təsirlər zamanı hüceyrələr sitozol marker fermenti olan laktat dehidrogenazanı öz daxilində saxlayırdı. Buna görə mənimsənilmənin itməsi sadəcə zəhərlənmə və ya membranın dağılması ilə izah olunmurdu.

Məqalədəki bir ehtiyat qeydi hələ də qüvvədədir. Mavi daxilolmalar nüvənin ətrafında yerləşirdi, lakin nüvənin içində deyildi; bu, hüceyrədaxili orqanoidlərdə oksidləşmə ilə uyğun gəlirdi, amma tədqiqat hansı orqanoidlərin iştirak etdiyini müəyyən etməmişdi. Digər hüceyrə tiplərində oxşar mənzərələr zəif sübutlar əsasında lizosomal adlandırılmışdı. Tutulma mexanizmini təsdiqlənmiş, onun yerini isə ilkin ehtimal kimi qəbul edin. Elektronların sonrakı istiqamətini izləyən oxucular mitoxondrial elektron daşınması və redoks prosesləri və daha geniş mövzu olan tətbiq yoluna görə sorulma və paylanma barədə oxumağa davam edə bilərlər.

Boyanma məruzqalma demək deyil

Üçüncü tədqiqat bu mənimsənilmə mexanizmi bioloji göstərici ilə qarşılaşanda nə baş verdiyini göstərir. Scott və həmkarları halqaşəkilli, torus quruluşlu şəkər olan metil beta siklodekstrinin metilen mavisinə birbaşa bağlandığını müəyyən etdilər. Daxiletmə kompleksi üçün assosiasiya sabiti təxminən 310 molyar⁻¹, boyağın dimerləşməsi üçün isə təxminən 5846 molyar⁻¹ idi. L929 fibroblastlarında bu bağlanma həm hüceyrələrin boyanmasının, həm də qlükoza mənimsənilməsinin stimullaşdırılmasının qarşısını alırdı: siklodekstrinlə əvvəlcədən inkubasiya mavi boyanmanın qarşısını alır, onun sonradan əlavə edilməsi isə rəngin itirilməsini sürətləndirirdi. Hüceyrələrdən mavi optik siqnal yox olduqca aktivləşmiş qlükoza daşınması da onunla sıx paralel şəkildə azalırdı.

Müəlliflər bu korrelyasiyanı uzunmüddətli oksidləşdirici stress mexanizmindən daha çox, boyaqla qlükoza daşıyıcısının aktivləşmə yolundakı bir zülal arasında birbaşa qarşılıqlı təsirin lehinə şərh etdilər. Bu nəticə əsaslıdır, lakin məhduddur. Təcrübə zülalın kimliyini müəyyən etmir, daşıyıcının özünə bağlanmanı göstərmir və rəngin itməsi ilə təsirin itməsi arasındakı korrelyasiya bütün redoks vasitəli yolları istisna edə bilməz.

Əsas və davamlı nəticə ölçmə ilə bağlıdır. Optik boyanma görünən, oksidləşmiş və hüceyrə ilə əlaqəli boyağı göstərir. Rəngsiz reduksiya olunmuş forma ehtiyatını isə tamamilə nəzərdən qaçırır. Buna görə zəif rənglənmiş hüceyrədə hələ də boyaq ekvivalentləri ola bilər; intensiv boyanmış hüceyrə isə toxumanın ümumi məruzqalmasını və ya təsirin böyüklüyünü deyil, tutulmuş oksidləşmiş boyağı göstərir. Eyni ehtiyat yanaşması daha geniş miqyasda da keçərlidir: müxtəlif hüceyrə tiplərinin boyanmasını müqayisə etmək və ya tünd rəngli toxuma kəsiyini daha yüksək məruzqalmanın sübutu saymaq qabdakı ilkin yanlışı təkrarlayır. Mənimsənilmə reduksiya, diffuziya və təkrar oksidləşmə dövrəsidir; mavi formanın hər hansı tək anlıq görüntüsü isə onun yalnız bir hissəsini göstərir. Laboratoriyada boyanma və boyaqla işləmə üçün praktik nəticələr, eləcə də doza və məruzqalma ilə bağlı iddiaların şərhi birbaşa bundan irəli gəlir.