ሜቲሊን ብሉ የማይቶኮንድሪያ ኮምፕሌክስ IIIን በአማራጭ መንገድ ማለፍ ይችላል? ጥናቶች ለምን ይለያያሉ

ሁለት ላቦራቶሪዎች ሜቲሊን ብሉ የታገደ የማይቶኮንድሪያ ኮምፕሌክስ IIIን በአማራጭ መንገድ ማለፍ ይችል እንደሆነ ጠየቁ። አንዱ አይችልም አለ። ሌላው ይችላል አለ። ሁለቱም መረጃ ነበራቸው።

በአይጥ አንጎል ማይቶኮንድሪያ ላይ የተደረገው የመጀመሪያው ጥናት፣ ቀለሙ እንደማይችል አገኘ። ከሦስት የአይጥ ዝርያዎች በተወሰዱ የአንጎል ማይቶኮንድሪያዎች ላይ የተደረገው ሁለተኛው ጥናት፣ በከፊል እንደሚችል አገኘ። በአይጥ ጉበት ላይ የተደረገ ሦስተኛ ጥናት ብዙ ጊዜ ከእነዚህ ጋር አብሮ ይጠቀሳል፤ የፈተነው ግን ሌላ ነገር ነው። ያንን በራሱ አውድ ካዩት፣ ግማሹ ግራ መጋባት ይጠፋል።

እዚህ ላይ ለሁሉም ሁኔታዎች የሚሠራ የአሠራር ዘዴ አለ ለማለት አይቻልም። የተለያዩ አጋጆችን፣ መጠኖችን እና የመለኪያ ውጤቶችን የተጠቀሙ ሦስት ሙከራዎች አሉ። መጀመሪያ ሁኔታዎቹን ያንብቡ። ድምዳሜዎቹ ከዚያ ይከተላሉ።

እዚህ በአማራጭ መንገድ ማለፍ ምን ማለት ነው

ኤሌክትሮኖች ወደ ሰንሰለቱ በኮምፕሌክስ I በኩል ከNADH፣ ወይም በኮምፕሌክስ II በኩል ከሱክሲኔት ይገባሉ፤ በኮምፕሌክስ III በኩል ወደ ሳይቶክሮም c ያልፋሉ፣ ከዚያም በኮምፕሌክስ IV በኩል ወደ ኦክሲጅን ይደርሳሉ። በመንገዱ ላይ የሚፈጠረውን ግራዲየንት ሕዋሱ ATP ለማምረት ይጠቀምበታል።

በአማራጭ መንገድ ያልፋል የሚለው አባባል፣ ሜቲሊን ብሉ ከእገዳው በፊት ኤሌክትሮኖችን ተቀብሎ ከእገዳው በኋላ ወደሚገኝ ክፍል ያስተላልፋል ማለት ነው። ኦክሲዳይዝ የሆነው ቀለም ከNADH ወይም ከሰንሰለቱ የመጀመሪያ ክፍሎች ኤሌክትሮኖችን ተቀብሎ ሉኮሜቲሊን ብሉ ይሆናል፤ ይህ ኤሌክትሮን የተቀበለው ቅርጽ ደግሞ ኤሌክትሮኖቹን ለሳይቶክሮም c ይሰጣል ወይም ወደ ሰንሰለቱ መልሶ ያስገባል። ርክክቡ ከእገዳው በኋላ ወዳለ ክፍል ከሆነ፣ የሕዋስ መተንፈስ እና የሽፋን ኤሌክትሪክ እምቅ በከፊል ይመለሳሉ። ርክክቡ በእገዳው ቦታ ወይም ከእሱ በፊት ከሆነ ግን፣ ምንም አይመለስም።

የኮምፕሌክስ III አንድ ዝርዝር ጉዳይ የዚህን ክርክር ትልቅ ክፍል ይወስናል። ኮምፕሌክሱ ሁለት የአጋጅ መያዣ ቦታዎች ያሉትን የQ ዑደት ያካሂዳል። አንቲማይሲን ከQi ቦታ ጋር ይያያዛል። ማይክሶቲያዞል ከQo ቦታ ጋር ይያያዛል። ከእነዚህ አንዱን ብቻ የሚጠቀም ጥናት የፈተነው የኮምፕሌክሱን ግማሽ ብቻ ነው።

የመጀመሪያው ጥናት፦ በአይጥ አንጎል ማይቶኮንድሪያ ውስጥ በአማራጭ መንገድ ማለፍ አልተገኘም

ጉሬየቭ እና ባልደረቦቹ ከC57BL/6 አይጦች የአንጎል ኮርቴክስ የተወሰዱ፣ በዲጂቶኒን የተለዩ ማይቶኮንድሪያዎችን ተጠቅመው፣ በእያንዳንዱ ml ውስጥ 0.1 mg ፕሮቲን ባለበት ሁኔታ መለኩ። የምላሽ ግብዓቶቹ ሦስት ሁኔታዎችን ያካትቱ ነበር፦ ፓይሩቬት ከማሌት ጋር፣ እያንዳንዳቸው 5 mM፤ ሱክሲኔት በ10 mM ከግሉታሜት በ2 mM ጋር፤ እና L-ፕሮሊን በ10 mM። አጋጆቹ ሮቴኖን በ1 micromolar ለኮምፕሌክስ I፣ እና አንቲማይሲን በ1 microgram per ml ለኮምፕሌክስ III ነበሩ። የቀለሙ መጠኖች 0.5፣ 1 እና 2 micromolar ሲሆኑ፣ ዋናው ክምችት 1 micromolar ነበር። ዘዴዎቹና የመለኪያ መስመሮቹ በFEBS Letters አጭር ጽሑፍ ውስጥ ይገኛሉ።

ኮምፕሌክስ Iን በአማራጭ መንገድ ማለፍ ሠርቷል። ሮቴኖን በADP የተነቃቃውን የሕዋስ መተንፈስ ከ121 ገደማ ወደ 2 nmol per minute per mg ገደማ ቀነሰው፤ በ1 micromolar ያለ ቀለም ደግሞ ወደ 21 ገደማ መለሰው። ፓይሩቬት ከማሌት ጋር ሲጠቀሙ፣ እንዲሁም L-ፕሮሊን ሲጠቀሙ፣ የሽፋን ኤሌክትሪክ እምቅ ተመለሰ።

ኮምፕሌክስ IIIን በአማራጭ መንገድ ማለፍ ግን አልሠራም። አንቲማይሲን የሕዋስ መተንፈስን ወደ 16 ገደማ ቀነሰው፣ ቀለሙም ወደ 20 ገደማ ብቻ አደረሰው። የቀለሙ መጠን እስከ 5 micromolar ቢደርስም፣ በማንኛውም የምላሽ ግብዓት ላይ የሽፋን ኤሌክትሪክ እምቅ አልተመለሰም። የፔሮክሳይድ መረጃም ተመሳሳይ ነገር አሳየ፦ ቀለሙ ብቻውን የፔሮክሳይድ ልቀትን ከመነሻ መጠኑ 76 pmol per minute per mg ገደማ፣ በሦስቱ መጠኖች ወደ 1170፣ 1460 እና 1945 ገደማ አሳደገው፤ አንቲማይሲን ግን ይህን በቀለሙ የተነሳውን ምልክት በቅደም ተከተል በ25፣ 88 እና 96 percent ገደማ ቀነሰው። ኤሌክትሮን የተቀበለው ቀለም በቀጥታ ከኦክሲጅን ጋር ምላሽ ቢሰጥ ኖሮ፣ ኮምፕሌክስ IIIን ማገድ ምልክቱን ማዳከም አልነበረበትም። ደራሲዎቹ ኤሌክትሮን የተቀበለው ቀለም፣ ከአንቲማይሲን እገዳ በፊት ባለው የኮምፕሌክስ III Qo ቦታ ኦክሲዳይዝ እንደሚሆን ደመደሙ። አጭሩ ዑደት በቃላት፦ ከለጋሾች ወደ ቀለሙ፣ ከቀለሙ ወደ Qo፣ ከዚያ በመደበኛው መንገድ ወደፊት። ሮቴኖን በአማራጭ መንገድ ይታለፋል። አንቲማይሲን ግን አይታለፍም።

ሁለተኛው ጥናት፦ በሦስት ዝርያዎች፣ በሁለቱም የአጋጅ ቦታዎች ላይ በከፊል በአማራጭ መንገድ ማለፍ

ስቫብ እና ባልደረቦቹ የሙከራውን ንድፍ አስፋፉ። ከአይጦች፣ ከራቶች እና ከጊኒ ፒጎች የአንጎል ማይቶኮንድሪያዎችን ወስደው በፐርኮል ለዩ፤ በተመሳሳይ 0.1 mg per ml ክምችት፣ ፓይሩቬት ከማሌት ጋር ወይም ግሉታሜት ከማሌት ጋር፣ እያንዳንዳቸው በ5 mM ሲኖሩ መለኩ። ሁለት የኮምፕሌክስ III አጋጆችን ተጠቀሙ፦ አንቲማይሲን A በ0.3 micromolar እና ማይክሶቲያዞል በ1 micromolar። ቀለሙ በአብዛኛዎቹ መለኪያዎች 2 micromolar፣ በሳይቶክሮም c ሙከራዎች ደግሞ 0.5 ነበር። ለሦስቱም ዝርያዎች ተመሳሳይ ፕሮቶኮሎችን የተጠቀሙት ሙከራዎች በበነጻ ሊነበብ የሚችለው ጥናት ውስጥ ይገኛሉ።

በሦስቱም ዝርያዎች፣ ሁለቱም እገዳዎች በከፊል በአማራጭ መንገድ ታለፉ። በአይጥ ማይቶኮንድሪያ ውስጥ አንቲማይሲን የሕዋስ መተንፈስን አዳከመ፣ ቀለሙም በ60 percent ገደማ፣ ከ37 ገደማ ወደ 59 nmol per minute per mg አሳደገው። ማይክሶቲያዞል በ88 percent፣ ወደ 4.5 ገደማ ቀነሰው፤ ቀለሙም አምስት እጥፍ አሳድጎ ወደ 23 ገደማ አደረሰው። ከሁለቱ አጋጆች በማንኛውም ስር፣ የሽፋን ኤሌክትሪክ እምቅ በከፊል እንደገና ተመለሰ፤ በብርሃን መለኪያ የሚፈጠሩ ሰው ሠራሽ ስህተቶችን ለማስወገድ፣ ይህ በሁለት ቀለሞች፣ በሳፍራኒን O እና በጥምርታ በሚለካ TMRM ተነበበ።

ይህ ጥናት የመጀመሪያው ጥናት ያላደረገውን፣ የኤሌክትሮን ርክክቡን በቀጥታ መፈተንም አደረገ። ከውጭ የተጨመረ፣ በ25 micromolar ያለ አሴቲሌት የተደረገ ሳይቶክሮም c፣ አጋጆች ቢኖሩም ባይኖሩም በኃይል የተነቃቁ ማይቶኮንድሪያዎች ኤሌክትሮን አልተቀበለም፤ ቀለሙን መጨመር ግን በሁለቱም ሁኔታዎች ኤሌክትሮን እንዲቀበል አደረገው። ሕዋስ በሌለበት ባፈር ውስጥ፣ NADH ከቀለሙ ጋር ሲሆን ሳይቶክሮም cን ከNADH መጠን ጋር ተመጣጣኝ በሆነ ፍጥነት ኤሌክትሮን እንዲቀበል አደረገ። ረዘም ያለው ዝላይ በቃላት፦ ከኤሌክትሮን ለጋሽ እኩል አቅሞች ወደ ቀለሙ፣ ከቀለሙ በቀጥታ ወደ ሳይቶክሮም c፣ ከኮምፕሌክስ IV ወደ ኦክሲጅን። ይህ መንገድ ኮምፕሌክስ IIIን ሙሉ በሙሉ ይዘላል፣ ስለዚህ ሁለቱንም አጋጆች በአማራጭ መንገድ ማለፍ ይቻላል።

ሁለት ተጨማሪ የመለኪያ ውጤቶች ይህን ትርጓሜ ይደግፋሉ። በማይክሶቲያዞል በታከሙ ማይቶኮንድሪያዎች ላይ ቀለሙ ሲጨመር፣ የNAD(P)H ፍሎረሰንስ ቀነሰ፤ ይህም ኤሌክትሮን ለጋሽ እኩል አቅሞች በአዲሱ መንገድ እየወጡ እንደነበር ያሳያል። በ660 nm የቀለሙ የብርሃን መምጠጥ መለኪያም እያንዳንዱን ጭማሪ በተራው ተከታተለ፤ በሴንትሪፉጅ ከተለዩ በኋላ የቀሩት የላይኛው ፈሳሽ ክፍሎች ደግሞ፣ ኦክሲዳይዝ የሆነው ቀለም በኃይል የተነቃቁ ማይቶኮንድሪያዎች ውስጥ ከመቶ እጥፍ በላይ እንደሚከማች፣ ከዚያም የኤሌክትሪክ እምቁ ሲፈርስ እንደሚወጣ አሳዩ። የፕሮቶን ሂሳቡም ከዚህ ጋር ይስማማል፦ የፕሮቶን ፓምፕ ደረጃዎችን መዝለል፣ ለእያንዳንዱ ጥንድ ኤሌክትሮን ከ10 ይልቅ 2 ፕሮቶኖች ገደማ ብቻ ያስቀራል። ስለዚህ ፈጣን የኦክሲጅን አጠቃቀም ከከፊል የኤሌክትሪክ እምቅ መመለስ ጋር መታየቱ፣ እውነተኛ በአማራጭ መንገድ ማለፍ የሚመስለው ይህን ነው፤ ይህ ማለፍ እንደሌለ ማስረጃ አይደለም።

ይኸው የሙከራ ዝግጅት፣ በጥንቃቄ ሳይነበብ ከታየ ወደ ስህተት የሚመራ ምላሽ አሳየ። አጋጁ ከቀለሙ ጋር ሲኖር፣ ADP የሕዋስ መተንፈስን ከማሳደግ ይልቅ ቀነሰው፤ የማጓጓዝ እገዳ ደግሞ ከማዘግየት ይልቅ አነቃቃው። ሆኖም የሽፋን ኤሌክትሪክ እምቅ አሁንም በመደበኛዎቹ አቅጣጫዎች ተለወጠ። በዚህ ስርዓት የኦክሲጅን ፍጆታ ብቻውን ያሳስታል።

ሦስተኛው ጥናት፦ IIIን ሳይሆን ኮምፕሌክሶች I እና IIን የፈተነው የጉበት ጥናት

ሊ እና ቦልስተርሊ የአይጥ ጉበት ማይቶኮንድሪያዎችን እና በባህል ያደጉ የጉበት ሕዋሳትን ተጠቀሙ። እነዚህም በኤፋቪሬንዝ፣ ኮምፕሌክስ I ላይ IC50 ከ30 micromolar ጋር በሚቀራረብበት፣ እና በሃይድራዚን፣ የኢሶኒያዚድ ሜታቦላይት ሆኖ ኮምፕሌክስ II ላይ IC50 ከ30 micromolar ጋር በሚቀራረብበት፣ ተጎድተው ነበር። በ30 micromolar ገደማ ያለ ቀለም የNADH ኦክሲዴሽንን፣ የሽፋን ኤሌክትሪክ እምቅን እና ATPን መለሰ፣ በተመሳሳይ ጊዜም ኦክሲዳንቶችን እና የኔክሮሲስ ሕዋስ ሞትን ቀነሰ። የRedox Biology ጥናት ይህን፣ ቀለሙ ኤሌክትሮኖችን በተጎዱት ኮምፕሌክሶች I እና II ዙሪያ በአማራጭ መንገድ እንደሚያሳልፍ ሞዴል ያቀርበዋል።

ያ ውጤት ከሰንሰለቱ የቀደሙ ክፍሎች ጋር የተያያዘ የተረጋገጠ አውድ ነው፤ በሙከራው ውስጥ ኮምፕሌክስ III ላይ ምንም እገዳ ስላልነበረ፣ ስለ ኮምፕሌክስ III ምንም አይናገርም። ከሁለቱ የአንጎል ጥናቶች ማንኛውንም ማረጋገጥ ወይም ማስተባበል አይችልም።

የሁኔታዎች ማነጻጸሪያ ሰንጠረዥ

ሁለቱም የኮምፕሌክስ III ጥናቶች ስለ ራሳቸው የሙከራ ሁኔታ ትክክል ሊሆኑ የሚችሉባቸው አራት ምክንያቶች

1. አጋጁ ተመሳሳይ ጣልቃ ገብነት አልነበረም። በአንድ በኩል አንቲማይሲን ብቻ በ1 microgram per ml፤ በሌላ በኩል አንቲማይሲን በ0.3 micromolar እና የተለየ የQo ቦታ አጋጅ። ኤሌክትሮኖችን ወደ Qo ቦታ የሚያስገባ የቀለም መንገድ፣ በቀጥታ ወደ ሳይቶክሮም c የሚሄድ መንገድ በሚሳካበት ሁኔታ ራሱ አይሳካም። አንድ ቦታ ሁለቱንም ሊወክል አይችልም።

2. የቀለሙ መጠን እና ጊዜ ይለያዩ ነበር። ዋና ክምችቶቹ 1 እና 2 micromolar ነበሩ። ይህ ሬዶክስን በዑደት የሚያካሂድ ንጥረ ነገር ሲሆን፣ ወደ ውስጥ መወሰዱ እና ሳይቶክሮም cን በቀጥታ ኤሌክትሮን እንዲቀበል ማድረጉ በክምችት እና በጊዜ ይወሰናሉ። ትናንሽ የመጠን ልዩነቶች ከተለያዩ የመለኪያ ጊዜዎች ጋር፣ የአንድ መረብ የተለያዩ ክፍሎችን ሊያሳዩ ይችላሉ።

3. የዝግጅት ዘዴዎቹ ይለያዩ ነበር። በዲጂቶኒን መለየት እና በፐርኮል ግራዲየንት መለየት፣ የጋራ ክፍሎች ቢኖራቸውም ፍጹም ተመሳሳይ ያልሆኑ የማይቶኮንድሪያ ቡድኖችን ይመርጣሉ። የፕሮቲን ክምችት በሁለቱም 0.1 mg per ml ስለነበር፣ ያ ተለዋዋጭ ከልዩነቱ ምክንያቶች ይወጣል፤ የንዑስ ቡድኖች ልዩነት እና መዋቅራዊ ጤንነት ግን አይወጡም። ዝርያው የልዩነቱ ምክንያት ነው የሚለው ጥርጣሬም ተወግዷል፤ ሁለተኛው ቡድን ያንኑ የሚታይ ምላሽ በአይጥም ደግሞ አግኝቷል።

4. የምላሽ ግብዓት ሁኔታ ቀለሙ ምን ሊያደርግ እንደሚችል ይወስናል። በአንድ በኩል ሦስት የምላሽ ግብዓት ሁኔታዎች፤ በሌላ በኩል ከNADH ጋር የተያያዙ ጥንዶች። የNADH አቅርቦት እና የሽፋን ኤሌክትሪክ እምቅ በጋራ፣ ቀለሙ ምን ያህል በፍጥነት ኤሌክትሮን እንደሚቀበል እና በየት እንደሚከፋፈል ይወስናሉ። ኦክሲዳይዝ ከሆነ ሳይቶክሮም c አጠገብ ኤሌክትሮን የተቀበለ ቀለም የሚፈልግ መንገድም፣ በዚያ ምርጫ ላይ ጥገኛ ነው።

ቀጣዩን በአማራጭ መንገድ ያልፋል የሚል አባባል እንዴት ማንበብ ይገባል

የትኛው ኮምፕሌክስ፣ በየትኛው አጋጅ፣ በየትኛው ቦታ እና በምን መጠን እንደታገደ ይጠይቁ። የቀለሙን ክምችት እና መለኪያው መቼ እንደተወሰደ ይጠይቁ። ቲሹውን፣ ዝርያውን፣ የመለየት ዘዴውን፣ የፕሮቲን ክምችቱን እና የምላሽ ግብዓቱን ይጠይቁ። እንዲሁም የኤሌክትሪክ እምቅ፣ የሕዋስ መተንፈስ፣ የሬዶክስ ሁኔታ እና ቀጥተኛ የኤሌክትሮን ርክክብ መለኪያ ውጤቶች ይስማሙ እንደሆነ ይጠይቁ፤ ምክንያቱም እዚህ የኦክሲጅን ፍጆታ ብቻውን ከአንድ ጊዜ በላይ ወደ ተሳሳተ አቅጣጫ አመልክቷል።

የተወሰነው ማጠቃለያ ይጸናል። ቀለሙ ኮምፕሌክስ Iን በአማራጭ መንገድ እንደሚያልፍ ስምምነት አለ። ኮምፕሌክስ IIIን በተመለከተ፣ አንቲማይሲን በ1 microgram per ml እና ቀለሙ በ1 micromolar ሲኖሩ የአይጥ ማይቶኮንድሪያዎች ተግባራዊ በአማራጭ መንገድ ማለፍ አያሳዩም። በሌላ በኩል፣ አንቲማይሲን በ0.3 micromolar ወይም ማይክሶቲያዞል በ1 micromolar፣ ቀለሙም በ2 micromolar ሲኖር፣ ሦስቱ ዝርያዎች ከቀለሙ ወደ ሳይቶክሮም c በቀጥታ የሚደረግ ዝውውር ያለበት ከፊል በአማራጭ መንገድ ማለፍ ያሳያሉ። እነዚህ አባባሎች አብረው ሊኖሩ ይችላሉ። ከዚህ የሚሰፋ ማንኛውም ድምዳሜ ከተፈተነው ወሰን በላይ ማጠቃለል ነው።

ተዛማጅ ንባብ አከራካሪውን አባባል በማያከራክር ኬሚስትሪ አውድ ውስጥ ያቆየዋል፦ ስለ ቅብብሎሹ ሜቲሊን ብሉ ኤሌክትሮኖችን እንዴት እንደሚያንቀሳቅስ፣ ስለ ተረጋገጠው የሰንሰለቱ የቀደመ ክፍል ጉዳይ ኮምፕሌክስ Iን በአማራጭ መንገድ የማለፍ ሙከራዎች፣ ሁለት ቀለሞች ለምን እንዳስፈለጉ የሽፋን ኤሌክትሪክ እምቅ መለኪያዎች እና በእነሱ የሚፈጠሩ ሰው ሠራሽ ስህተቶች፣ እንዲሁም በመጠን እና በጊዜ ምርጫ የሚፈጠሩ ወጥመዶችን ለመረዳት ሬዶክስን በዑደት የሚያካሂዱ ንጥረ ነገሮችን በላቦራቶሪ እንዴት እንደሚያዙ የሚገልጽ ንባብ።