ለማይክሮስኮፒ የሜቲሊን ብሉ አማራጮች

ለቀላል የባክቴሪያ ስሚር፣ ዓላማው የሴል ቅርጽን ማየት ከሆነ ክሪስታል ቫዮሌት ሜቲሊን ብሉን ሊተካ ይችላል። ሕያው ሴሎችን ለመመልከት የተሻለው አማራጭ ምናልባት ምንም ቀለም ሳይጠቀሙ የፌዝ ኮንትራስት ዘዴ ሊሆን ይችላል። ምርጫው ማድረግ በሚፈልጉት ምልከታ ላይ ይመረኮዛል።

ሁለት ሰዎች ተመሳሳይ የባክቴሪያ ካልቸር እየመረመሩ እንደሆነ እናስብ። አንደኛው ዘንግ-ቅርጽ ያላቸውን ሴሎች ከክብ ሴሎች መለየት ይፈልጋል። ሌላው ደግሞ አንድ ሕክምና ባክቴሪያዎቹን ገድሏል ወይስ አልገደለም ማወቅ ይፈልጋል። ለመጀመሪያው ሰው ግልጽ ምስል የሚሰጥ ቀለም ለሁለተኛው ሰው ምንም ጠቃሚ መልስ ላይሰጥ ይችላል።

አማራጭ ከመምረጥዎ በፊት ይህን ዓረፍተ ነገር ያጠናቅቁ፦ “በ___ ውስጥ ___ ማየት እፈልጋለሁ፣ እና ሴሎቹ በሕይወት መቆየት አለባቸው / አያስፈልጋቸውም።” ይህ ዓረፍተ ነገር ቀለሙ ማከናወን ያለበትን ሥራ ይገልጻል።

ከናሙናው እና ከጥያቄው ይጀምሩ

መጀመሪያ ሴሎቹ በሕይወት መቆየት እንዳለባቸው ይወስኑ፣ ከዚያም ማየት የሚፈልጉትን ባህሪ ይለዩ፦

ሴሎቹ በሕይወት መቆየት አለባቸው፦ እንቅስቃሴን ወይም ቅርጽን ለማየት ያልተቀባ ፌዝ ኮንትራስት ወይም DIC ያስቡ፤ ለኒውክሌር DNA ከፍሎረሰንስ ጋር Hoechst 33342 ያስቡ፤ ለሜምብሬን ኢንተግሪቲ እንደ SYTO 9 ከ propidium iodide ጋር ያለ የተረጋገጠ አሰይ ይምረጡ።
ሴሎቹ በሕይወት መቆየት አያስፈልጋቸውም፦ ለባክቴሪያ ሞርፎሎጂ ቀላል የክሪስታል ቫዮሌት ቀለም ወይም የኒግሮሲን ኔጌቲቭ ስቴይን ያስቡ፤ ለGram ምላሽ ሙሉውን Gram-stain ዘዴ ይጠቀሙ፤ በተስተካከሉ ሴሎች ውስጥ ለኒውክሌር DNA የDAPI ፍሎረሰንስን ያስቡ።

የእያንዳንዱን አማራጭ ውስንነት ለማነጻጸር ይህን ሰንጠረዥ ይጠቀሙ። እነዚህ የዘዴ ምርጫዎች ናቸው፤ በነባር ፕሮቶኮል ውስጥ ጠርሙሶችን ለመቀያየር የተሰጡ መመሪያዎች አይደሉም።

ማየት የሚፈልጉት	ናሙና እና መሣሪያ	እጩ አማራጭ	ዋና ውስንነት
የባክቴሪያ ቅርጽ እና አደረጃጀት	የተዘጋጀ የባክቴሪያ ስሚር፤ brightfield	ቀላል የክሪስታል ቫዮሌት ቀለም	ሞርፎሎጂን ያሳያል፤ Gram ምላሽን ወይም ቫያቢሊቲን አያረጋግጥም።
በጨለማ ዳራ ላይ የሴል ወሰኖች	የባክቴሪዮሎጂ ዝግጅት፤ brightfield	የኒግሮሲን ኔጌቲቭ ስቴይን	ዝግጅቱ እና ፎርሙሌሽኑ ጠቃሚ ናቸው፤ ያልተቀባ ሴል ማለት በሕይወት አለ ማለት አይደለም።
Gram ምላሽ	የተዘጋጀ የባክቴሪያ ስሚር፤ brightfield	ሙሉ Gram-stain ዘዴ	ሙሉውን የሪኤጀንት ቅደም ተከተል እና መቆጣጠሪያዎች ይፈልጋል።
በሕያው ሴሎች ውስጥ እንቅስቃሴ ወይም ለውጦች	ተኳሃኝ እርጥብ ዝግጅት፤ phase contrast ወይም DIC	ምንም ቀለም የለም	ተስማሚ ኦፕቲክስ ይፈልጋል፤ ኮንትራስት ሞለኪውልን አይለይም።
ኒውክሌር DNA	የተስተካከሉ ሴሎች፤ fluorescence	DAPI	ተኳሃኝ excitation እና emission ፊልተሮች ይፈልጋል።
በሕያው ሴሎች ውስጥ ኒውክሌር DNA	ሕያው ሴሎች፤ fluorescence	Hoechst 33342	ወደ ሴል መግባቱ የምስል ማንሻ ሁኔታዎቹ ጉዳት የሌላቸው መሆናቸውን አያረጋግጥም።
የባክቴሪያ ሜምብሬን ኢንተግሪቲ	ያልተስተካከሉ ባክቴሪያዎች፤ fluorescence	SYTO 9 ከ propidium iodide ጋር	የሜምብሬን ቀለም ቫያቢሊቲን በተዘዋዋሪ የሚለካ መለኪያ ነው።

ለቀላል ስሚር ዘዴውን በጥንቃቄ ይቀይሩ

ተግባሩ የባክቴሪያ ሞርፎሎጂን በአንድ ቀለም ማየት ከሆነ ክሪስታል ቫዮሌት ተግባራዊ እጩ ነው። የFDA Bacteriological Analytical Manual ለቀላል ቀለም መቀባት ተስማሚ የሆኑ ሁለት የክሪስታል ቫዮሌት ፎርሙሌሽኖችን ይዘረዝራል። በሰነድ የተገለጸ ፎርሙሌሽን እና የዝግጅት ዘዴውን ይጠቀሙ፤ የቀለሙ ስም ብቻ ለሥራ ዝግጁ የሆነ ሪኤጀንትን አይገልጽም።

ክሪስታል ቫዮሌት በGram staining ውስጥም ይጠቀማል፣ ነገር ግን ይህ ቀላል የክሪስታል ቫዮሌት ቀለምን Gram stain አያደርገውም። በASM Gram-stain ፕሮቶኮል ውስጥ የልዩነት ውጤቱ ክሪስታል ቫዮሌት፣ iodine፣ decolorization እና counterstaining በቅደም ተከተል በመሥራታቸው ላይ ይመረኮዛል። እነዚያን ደረጃዎች ማስቀረት ምስሉ ምን ሊያረጋግጥ እንደሚችል ይቀይራል። ለዚህ ልዩነት ቀላል ቀለም መቀባት እና Gram staining ይመልከቱ።

ኒግሮሲን የወሰን ቅርጾችን ለማሳየት የተለየ መንገድ ይሰጣል፦ ዳራውን ያጨልማል፣ የባክቴሪያ ሴሎቹ ግን በንጽጽር ቀላል ሆነው ይታያሉ። አጠቃላይ የአማራጮች ዝርዝር ሊያመልጠው የሚችል ጠቃሚ ዝርዝር በMerck የኒግሮሲን መመሪያዎች ውስጥ አለ። የተገለጸው የሥራ ፎርሙሌሽን formaldehyde ይዟል። ስለዚህ ሴሎቹ ራሳቸው ያልተቀቡ ቢመስሉም “negative stain” ከሚለው ቃል ብቻ ከሕያው ሴል ጋር ተኳሃኝ መሆኑን መደምደም አይችሉም። ሙሉውን ፎርሙሌሽን እና የናሙና ዝግጅት ያረጋግጡ።

ሕያው ናሙናዎችን ለማየት ኦፕቲክሱን መቀየር ያስቡ

ሴሎች ሲንቀሳቀሱ ወይም ሲከፋፈሉ መመልከት ከፈለጉ፣ ሌላ ቀለም መጨመር ምልከታውን ሊያወሳስብ ይችላል። Nikon በግልጽ ናሙናዎች ውስጥ ኮንትራስት መመሪያው እንደሚያብራራው፣ phase contrast እና differential interference contrast፣ ወይም DIC፣ በኦፕቲካል ባህሪያቸው ልዩነት አማካኝነት ናሙናዎችን እንዲታዩ ያደርጋሉ። ማይክሮስኮፑ አስፈላጊዎቹን ክፍሎች ካሟላ ሕያውና ያልተቀቡ ሴሎችን ማሳየት ይችላሉ።

ይህ ምርጫ ናሙናውን ያልተቀባ ሆኖ ያቆየዋል፣ ግን የሚገኘውን መረጃ ይቀይራል። የትኛው ሞለኪውል ኮንትራስቱን እንደፈጠረ ሳያውቁ ወሰንን ወይም እንቅስቃሴን መከታተል ይችላሉ። ጥያቄው የሞለኪውላር አካባቢ መለየት ከሆነ፣ ተስማሚ የላብሊንግ ዘዴ ይምረጡ።

ለኒውክሌር DNA፣ የInvitrogen የDAPI እና Hoechst ቀለሞች ንጽጽር በተስተካከሉ ሴሎች ጋር DAPI በተለምዶ መጠቀሙን ከይበልጥ ሴል-ፐርሚያንት ከሆነው Hoechst 33342 ይለያል፤ Hoechst 33342 ለሕያው ሴል ላብሊንግ ይመረጣል። ሁለቱም የfluorescence መሣሪያ ይፈልጋሉ። አንዳቸውም በbrightfield ውስጥ ለሚታይ ባለቀለም ስቴይን ቀጥተኛ ምትክ አይደሉም።

ለቀለም መጋለጥን እና ለብርሃን መጋለጥን እንደ የሙከራ ሁኔታዎች ይቁጠሩ። የሴሎቹ ባህሪ የሚለኩት ነገር ከሆነ፣ የተቀቡና ያልተቀቡ ዝግጅቶችን ያነጻጽሩ።

ቀይ ሴል ማለት በራሱ የሞተ ሴል ማለት አይደለም

SYTO 9 እና propidium iodide የባክቴሪያ ሜምብሬን ኢንተግሪቲን ለመገምገም ብዙ ጊዜ በጥንድ ይጠቀማሉ። BacLight ማኑዋል ያልተጎዱ ሜምብሬኖችን ከአረንጓዴ ቀለም ጋር፣ የተጎዱ ሜምብሬኖችን ደግሞ ከቀይ ቀለም ጋር ያዛምዳል። ይህ ትርጓሜ ለናሙናው መረጋገጥ ይፈልጋል።

በRosenberg እና ባልደረቦቹ የተካሄደ የ2019 ጥናት ችግሩን ያሳያል። በphosphate-buffered saline ውስጥ በመስታወት ላይ ባሉ የ24-hour E. coli biofilms ውስጥ፣ about 96% የሚሆኑት ሴሎች in situ propidium-iodide-positive ሆነው ታዩ። ሆኖም ደራሲዎቹ ከማሰባሰብ በኋላ 82% የሚሆኑት ሊታረሱ የሚችሉ እንደነበሩ ገመቱ። የConfocal ምስሎች በቀይ ከተቀባ ንጥረ ነገር በታች አረንጓዴ ውስጣዊ ክፍል ያላቸውን ሴሎች አሳዩ፣ ይህም extracellular nucleic acids ለአሳሳቹ ምልክት አስተዋጽኦ እንዳደረጉ ያመለክታል።

እነዚያ መቶኛዎች በጥናቱ ዝግጅቶች ላይ የተደረጉ የተለያዩ መለኪያዎችን ይገልጻሉ፤ ለሁሉም ሁኔታ የሚሠራ የማስተካከያ መጠን አይደሉም። ጠቃሚው ትምህርት ምልክቱን ምን እንደፈጠረው ማረጋገጥ ነው። በbiofilm ውስጥ nucleic-acid dye በተጎዱ ሴሎች ውስጥ ያለውን ብቻ ሳይሆን ከሴሎች ውጭ ያለውን ንጥረ ነገርም ሊያሳይ ይችላል። ስለቫያቢሊቲ ድምዳሜ ለመስጠት ተመራማሪዎቹ እያንዳንዱ ዘዴ ውስንነት እንዳለው በመግለጽ፣ እንደ cultivation ወይም metabolic activity ያሉ ተጨማሪ መለኪያዎችን ይመክራሉ።

አማራጩ በእውነት ምን እንደያዘ ያረጋግጡ

አማራጭ የቀለም መቀቢያ ዘዴ አሁንም ሜቲሊን ብሉ ሊይዝ ይችላል። Giemsa አንድ ምሳሌ ነው፦ Merck ምርቱን እንደ azure-eosin-methylene-blue solution ይገልጸዋል፣ እና ከአጠቃቀሞቹ መካከል የደም እና የbone-marrow smears ይገኛሉ። ለተለየ ናሙና የተለየ ዘዴ ሊሆን ይችላል፣ ነገር ግን ሜቲሊን ብሉን ማስወገድ የሚጠይቅ መስፈርትን አያሟላም።

አንድን ውህድ ማስወገድ የሙከራው አካል ከሆነ፣ ምስሎችን ከማነጻጸርዎ በፊት የሪኤጀንቱን ማንነት እና ፎርሙሌሽን ያረጋግጡ። methyl blue፣ methylene blue እና ተመሳሳይ ስም ያላቸው ቀለሞች መመሪያ የስያሜ ልዩነቶቹን ያብራራል።

ውጤቱን ከመጠቀምዎ በፊት ምትኩን ያረጋግጡ

ለአዲስ ዘዴ፣ ወካይ ናሙናዎችን እና ተገቢ መቆጣጠሪያን በመጠቀም ትንሽ ንጽጽር ያድርጉ። በተቻለ መጠን የማይክሮስኮፕ ቅንብሮቹን ተመጣጣኝ ያድርጉ። የሪኤጀንቱን ፎርሙሌሽን፣ የናሙና ዝግጅት፣ exposure እና imaging conditions ይመዝግቡ፣ በዚህም የተሻለ የሚመስል ምስል በቀላሉ ከመመረጥ ይልቅ ሊመረመር ይችላል።

ስኬቱን ከመጀመሪያው ጥያቄ አንጻር ይገምግሙ። ለሞርፎሎጂ፣ የሴል ወሰኖች እና አደረጃጀት አሁንም ሊተረጎሙ እንደሚችሉ ይገምግሙ። ለኒውክሌር ላብሊንግ፣ የሲግናሉን ቦታ እና ዳራውን ይገምግሙ። ለቫያቢሊቲ፣ ማራኪ የቀለም ልዩነት ብቻ ሳይሆን ተጨማሪ ማስረጃ ይጠይቁ። ሰፊው የሜቲሊን ብሉ ቀለም መቀባት እና የላቦራቶሪ አጠቃቀሞች መመሪያ ምልከታው እና ዝግጅቱ እንዴት እንደሚጣጣሙ ያብራራል።

የሚፈልጉትን መለኪያ የሚጠብቀውን አማራጭ ይምረጡ። ቀለም በመጨረሻው ምስል ውስጥ ካሉ ባህሪያት አንዱ ብቻ ነው።